一种榆黄菇中高抗氧化活性提取物及其制备方法

本发明涉及生物酶解，具体涉及一种榆黄菇中高抗氧化活性提取物及其制备方法。

背景技术：

1、麦角硫因(ergothioneine,egt)是一种人体必需的天然水溶性含硫氨基酸，具备良好的抗氧化、抗炎、抗癌、皮肤保护等多种生理功能。近年来，麦角硫因广泛应用于护肤品、药品、保健品领域，珀莱雅、迪奥、百植萃等多个国内外品牌均将egt添加到其产品中。全球egt市场在2020年的估值为1500万美元，预计到2027年底将达到1.25亿美元，年复合增长率为36.2％。egt的价格约为每公斤700美元，在未来有很大的市场潜力。

2、榆黄菇又名金顶侧耳，是侧耳科、侧耳属真菌。子实体一般中等大。菌盖草黄色至鲜黄色，光滑，漏斗形，边缘内卷，直径3—10厘米。菌肉白色，菌褶白色，密，延生，不等长。菌柄偏生，白色，内实，长2—10厘米，粗0.5—1.5厘米，往往基部相连。已有研究证实，榆黄菇含有丰富的麦角硫因，是麦角硫因生产的优势菌株。

3、榆黄菇食用价值极高，富含多糖、蛋白质、氨基酸、矿物质以及微量元素等多种活性成分，其中蛋白质含量高达42.12％，赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸等8种人体必需氨基酸含量高。具备抗氧化、抗炎、降血脂等多种生理功能，深受广大消费者的喜爱。以榆黄菇菌丝体为原料，使用物理剪切超声耦合生物酶法提取麦角硫因的同时，可以提取得到菌菇肽与菌菇多糖等更多的生物活性物质。

4、目前国内市场上多种食用菌深层发酵技术已被用于麦角硫因的生产，且大多数专利中提取蘑菇多糖等活性物质多以纤维素酶、果胶酶和蛋白酶破壁提取为主，但是从菌菇中提取麦角硫因以及衍生制备菌菇肽的方法鲜有研究。另一方面，多种成分的提取势必增加提取成本，且会引起活性产物损失，若能将麦角硫因、菌菇肽与多糖的提取过程耦联，开发新型加工工艺高效保留榆黄菇中不同的活性成分，将对麦角硫因衍生产品的开发具有重要意义。因此，亟需开发一种高效提取榆黄菇中抗氧化活性组合物的方法，以适应工业化生产。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种榆黄菇中高抗氧化活性提取物的制备方法，包括以下步骤：

2、(1)原料发酵：榆黄菇在蔗糖固体培养基上生长；菌菇平板菌丝破碎接种于初代种子培养基培养至形成大量菌丝或菌球；初代种子液破碎后按5％接种量接种于二代种子液培养3～4天；将培养好的种子液破碎接种于添加了终浓度10mm h2o2的发酵培养基，发酵培养5天；发酵5天后，向培养基中添加终浓度10mm的h2o2，刺激1h后，添加终浓度1.5g/l的维生素c，2h后收获菌丝体；

3、(2)预处理：将菌丝体抽滤去除发酵液，使用去离子水清洗三次，再与缓冲液按一定的进行混合分装，并使用物理超声剪切，调节ph后，添加纤维素酶和果胶酶进行菌菇多糖的提取；调节ph范围为3-10；

4、(3)向步骤(2)所得的预处理后样品中添加不同种类的蛋白酶，添加ph后，混合提取蛋白与多糖的同时进行水解反应，水浴煮沸高温灭酶并水提麦角硫因，离心后，制备得到麦角硫因、菌菇肽与多糖的粗提物；

5、(4)将步骤(3)所得的粗提物进行分层分离，上层为提取获得的麦角硫因、菌菇肽与多糖的组合物，检测其蛋白质、多肽多糖含量、多肽分子量、麦角硫因含量和抗氧化活性等各项评价指标，下层进行冷冻干燥，粉碎过筛后得到菌菇粉渣。

6、进一步的，所述步骤(2)中菌丝体、缓冲液的质量比为1∶5～1∶20；所述缓冲液为磷酸钾、硼酸硼砂盐、磷酸盐中的一种或几种的水溶液。

7、进一步的，所述步骤(2)中物理超声功率为65—325w，时间为10—30min，剪切机5000rpm破碎时间为0-3min。

8、进一步的，所述步骤(3)中纤维素酶和果胶酶的用量为菌丝体和缓冲液总质量的0.25％(w/w)～1％(w/w)；蛋白酶的用量为菌丝体和水总质量的0.25％(w/w)～1％(w/w)。

9、进一步的，所述步骤(3)中的蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶；所述中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶的酶活力分布为100、200、150u/mg。

10、进一步的，所述步骤(3)中离心转速为8000-12000r/min；离心时间为10—30min。

11、进一步的，所述步骤(3)中水提法并灭酶的温度为90℃～100℃，时间为30～60min。

12、进一步的，所述步骤(4)中低温冷冻干燥的设备为压盖型冷冻干燥机，冷阱温度为-60℃～-80℃，真空度为0-2pa。

13、进一步的，所述步骤(4)中粉碎过筛，过筛采用的过20-80目的筛网。

14、本发明还提供了一种榆黄菇中高抗氧化活性提取物，由上述制备方法制得。

15、本发明具有以下有益效果：

16、(1)本发明在传统热水浸提方法的基础上进行改进，建立了一种物化加工耦合生物酶法进行分步提取的方法，通过缓冲液稳定ph，利用超声剪切破碎细胞壁的同时促进酶解，并采用纤维素酶、果胶酶和复合蛋白酶进行破壁的同时，将榆黄菇细胞壁中的纤维素和蛋白质酶解成多糖与小肽类物质，同时可以促进麦角硫因的析出，使得榆黄菇中高值生物活性物质得到彻底的提取与利用，过程温和，绿色安全，更适合工业化生产。

17、(2)本发明选用榆黄菇菌丝体作为原料，物化方法联合酶解处理的加工方法，高效获得了菌菇肽、菌菇多糖和麦角硫因的提取物，其中麦角硫因的提取率提高了30％，所获得的提取物溶解度100％；在制备菌菇肽的过程中，水解度大于10％，其中，相对分子量小于10000da的肽占比大于90％，小于2000da的肽占比大于80％；提取物中蛋白质含量大于5g/l，多肽含量大于2g/l，菌菇多糖含量大于10g/l。

18、(3)采用本发明技术所提取的榆黄菇提取物具有显著的抗氧化活性，采用dpph自由基清除能力、fe2+螯合能力、还原力、frap总抗氧化能力四个指标评价其抗氧化活性，随着提取方式的改进，其相关的抗氧化活性也有了相对应的提升，活性的提升与提取物中活性物质的组成有密切关系。

技术特征：

1.一种榆黄菇中高抗氧化活性提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中菌丝体、缓冲液的质量比为1∶5～1∶20；所述缓冲液为磷酸钾、硼酸硼砂盐、磷酸盐中的一种或几种的水溶液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中物理超声功率为65—325w，时间为10—30min，剪切机5000rpm破碎时间为0-3min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中纤维素酶和果胶酶的用量为菌丝体和缓冲液总质量的0.25％(w/w)～1％(w/w)；蛋白酶的用量为菌丝体和水总质量的0.25％(w/w)～1％(w/w)。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶；所述中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、的酶活力分布为100、200、150u/mg。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中离心转速为8000-12000r/min；离心时间为10—30min。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中水提法并灭酶的温度为90℃～100℃，时间为30～60min。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中低温冷冻干燥的设备为压盖型冷冻干燥机，冷阱温度为-60℃～-80℃，真空度为0-2pa。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中粉碎过筛，过筛采用的过20-80目的筛网。

10.一种榆黄菇中高抗氧化活性提取物，其特征在于，由权利要求1-9所述的方法制得。

技术总结
本发明涉及生物酶解技术领域，具体涉及一种榆黄菇中高抗氧化活性提取物及其制备方法。首先液态培养榆黄菇，采用剪切破碎后水提法，得到麦角硫因产量可达641.76mg/L的榆黄菇培养液。本发明在传统热水浸提的基础上进行改进，通过物化加工耦合生物酶进行分步水解提取法，采用纤维素酶、果胶酶和复合蛋白酶进行破壁的同时，将榆黄菇细胞壁中的纤维素和蛋白质酶解成多糖与小肽类物质，同时可以促进麦角硫因的析出，使得榆黄菇中高值生物活性物质得到彻底的提取与利用，抗氧化活性优秀，过程温和，绿色安全，更适合工业化生产。

技术研发人员：任路静,郭迅,胡学超,马回国,张学琼,翁裕婉
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24