用于检测甲状腺癌的组合物及其用途的制作方法

本技术属于分子生物学领域，涉及基因检测，具体的是涉及一种用于检测甲状腺癌的组合物及其用途。

背景技术：

1、基于国家癌症中心数据，2016年甲状腺癌(thyroid carcinoma)新发病例为20.3万，死亡病例为0.8万。甲状腺癌预后较好，死亡率较低，但发病速度持续增长。

2、甲状腺癌包括乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌四种病理类型。以恶性度较低、预后较好的乳头状癌最常见，除髓样癌外，绝大部分甲状腺癌起源于滤泡上皮细胞。发病率与地区、性别等有一定关系。女性发病较多，男女发病比例为1∶(2～4)。任何年龄均可发病，但以青壮年多见。绝大多数甲状腺癌发生于一侧甲状腺腺叶，常为单个肿瘤。

3、目前甲状腺癌的早期诊断主要还是依赖于影像学手段发现结节，结节的进一步穿刺检查等传统方式，检查效率低且检出灵敏度不高。比如颈部超声检查虽然灵敏性较好，但对甲状腺结节的鉴别能力与超声医师的临床经验相关。ct对最大直径≤5mm结节及弥漫性病变合并结节的患者观察欠佳。mri对钙化不敏感，检查时间长，易受呼吸和吞咽动作影响。因此，早期甲状腺癌尺寸小，传统方法不易发现，且目前的检查效率低下，不适用大规模普及筛查。

4、近年的研究显示表观遗传学在癌症的发生、发展中起着重要作用。作为表观遗传学的一种重要机制，多种癌症的dna甲基化调控得到了深入研究。研究数据显示：基因甲基化的调控与染色质结构和基因表达调控等生物学机制相关；细胞基因甲基化的变化发生在肿瘤形成的早期，并贯穿癌症的发生和发展过程；抑癌基因的甲基化是癌前病变组织转化为恶性肿瘤细胞的重要分子机制。但是目前缺乏针对甲状腺癌甲基化基因检测的检测技术、方法和产品。因此，当前对用于甲状腺癌检测的敏感性高和特异性高的甲基化基因标记物存在需求。

技术实现思路

1、基于现有甲状腺癌检测中存在的问题，本技术的目的在于提供一种用于检测甲状腺癌的组合物及其用途。

2、本技术具体技术方案如下：

3、1.一种用于体外检测甲状腺癌的组合物，所述组合物包括：

4、用于检测目标基因甲基化状态的核酸，

5、其中，所述目标基因甲基化状态由所述目标基因的靶序列的甲基化来表征，

6、其中，所述目标基因为mir578基因、foxn3基因和sptbn1基因中的一种、两种或三种。

7、2.根据项1所述的组合物，其中，所述mir578基因的靶序列如seq id no：1-4中任一个所示，或包括seq id no：1-4中任一个所示的序列。

8、3.根据项1所述的组合物，其中，所述foxn3基因的靶序列如seq id no：5-8中任一个所示，或包括seq id no：5-8中任一个所示的序列。

9、4.根据项1所述的组合物，其中，所述sptbn1基因的靶序列如seq id no：9-12中任一个所示，或包括seq id no：9-12中任一个所示的序列。

10、5.根据项1～4中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括：

11、引物，所述引物为所述目标基因的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，所述片段包含至少一个cpg二核苷酸序列。

12、6.根据项1～5中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括：

13、探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下杂交于所述目标基因的靶序列中的至少15个核苷酸的片段，

14、所述片段包含至少一个cpg二核苷酸序列。

15、7.根据项1～6中任一项所述的组合物，其还包括：

16、将目标基因的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。

17、8.根据项1～7中任一项所述的组合物，其中所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸还包括：

18、优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。

19、9.根据项8所述的组合物，其中，

20、所述至少9个核苷酸的片段，其为seq id no：13和seq id no：14的序列，或者其为seq id no：16和seq id no：17的序列，或者其为seq id no：19和seq id no：20的序列；

21、所述至少15个核苷酸的片段，其为seq id no：15的序列，或seq id no：18的序列，或seq id no：21的序列。

22、10.一种用于体外检测甲状腺癌的寡核苷酸，其包括：

23、所述seq id no：1或seq id no：2或seq id no：3或seq id no：4或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个cpg二核苷酸序列的片段；和/或

24、所述seq id no：5或seq id no：6或seq id no：7或seq id no：8或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个cpg二核苷酸序列的片段；和/或

25、所述seq id no：9或seq id no：10或seq id no：11或seq id no：12或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个cpg二核苷酸序列的片段。

26、11.根据项10所述的寡核苷酸，其还包括：

27、在中等严紧或严紧条件下杂交于所述seq id no：1或seq id no：2或seq id no：3或seq id no：4或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个cpg二核苷酸序列的片段；和/或

28、在中等严紧或严紧条件下杂交于所述seq id no：5或seq id no：6或seq id no：7或seq id no：8或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个cpg二核苷酸序列的片段；和/或

29、在中等严紧或严紧条件下杂交于所述seq id no：9或seq id no：10或seq id no：11或seq id no：12或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个cpg二核苷酸序列的片段。

30、12.根据项11所述的寡核苷酸，其还包括：

31、优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。

32、13.一种用于体外检测甲状腺癌的寡核苷酸，其包括：

33、seq id no：13和seq id no：14的序列。

34、14.根据项13所述的寡核苷酸，其还包括：

35、seq id no：15的序列。

36、15.一种用于体外检测甲状腺癌的寡核苷酸，其包括：

37、seq id no：16和seq id no：17的序列。

38、16.根据项15所述的寡核苷酸，其还包括：

39、seq id no：18的序列。

40、17.一种用于体外检测甲状腺癌的寡核苷酸，其包括：

41、seq id no：19和seq id no：20的序列。

42、18.根据项17所述的寡核苷酸，其还包括：

43、seq id no：21的序列。

44、19.一种试剂盒，其包括项1～9中任一项所述的组合物或包括项10～18中任一项所述的寡核苷酸。

45、20.根据项19所述的试剂盒，其还包含选自下述的至少一种其它组分：

46、三磷酸核苷、dna聚合酶和所述dna聚合酶功能所需的缓冲液。

47、21.根据项19或20所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于检测的样本包括：细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。

48、22.根据项19～21中任一项所述的试剂盒，其还包含：说明书。

49、23.根据项1～9中任一项所述的组合物或项10～18中任一项所述的寡核苷酸在制备用于体外检测甲状腺癌的试剂盒中的用途。

50、24.mir578基因、foxn3基因或sptbn1基因在制备用于体外检测甲状腺癌的试剂盒中的用途。

51、25.根据项24所述的用途，其中，所述mir578基因的靶序列如seq id no：1-4中任一个所示，或包括seq id no：1-4中任一个所示的序列。

52、26.根据项24所述的用途，其中，所述foxn3基因的靶序列如seq id no：5-8中任一个所示，或包括seq id no：5-8中任一个所示的序列。

53、27.根据项24所述的用途，其中，所述sptbn1基因的靶序列如seq id no：9-12中任一个所示，或包括seq id no：9-12中任一个所示的序列。

54、发明的效果

55、本技术具有以下有益效果：

56、通过检测mir578基因、foxn3基因和/或sptbn1基因这三个甲状腺癌甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测这3个基因的甲基化状态，从而可以用于对外周血游离dna的检测。

57、通过对甲状腺癌患者和正常对照个体的外周血样本的检测显示：本技术的系统和方法能够灵敏和特异地检测甲状腺癌，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。因此，本技术提供了一种检测甲状腺癌的系统和方法，具有重要的临床应用价值。本技术利用表观基因组和生物信息学技术，通过分析甲状腺癌的基因组甲基化数据，寻找到了多个与甲状腺癌相关的甲基化基因，并确定了甲状腺癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列，并且通过这个甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离dna的检测。

58、本技术所述的组合物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，降低了侵入性检测造成的危害，所述的组合物具有更高的灵敏度和准确度，能够实现实时监测。