肺癌MRD检测用捕获探针池和试剂盒的制作方法

本发明属于生物，涉及分子生物学检测，具体是涉及一种肺癌mrd检测用捕获探针池和试剂盒。

背景技术：

1、微小残留病灶(minimal residual disease,mrd)又称为可测量残留病灶(measurable residual disease)、分子残留病灶(molecular residual disease)，指癌症患者治疗后传统影像学或实验方法检测不到的但通过液体活检可检出极少量癌细胞残存或癌细胞来源分子异常(wang y et al.,biomedical transformation,2021,2:49-59)。mrd中包括微小复发性残留灶(m-rec)、微小非复发性残留灶(mn-rec)、微小残留灶前体(mrps)、微小残留核酸(mrnas)和微小残留代谢物(mrms)(luskin mr et al.,nat revcancer,2018,18:255-263)。除了mn-rec，m-rec和mrps都是肿瘤发展隐匿阶段mrd引发远期复发的可能之一，mrnas和mrms也可能与肿瘤的复发相关。因此，mrd被认为是癌症复发/转移的主要原因。

2、在肺癌中，mrd是患者远期转移复发的潜在来源，在肺癌病程中对mrd的监测十分重要。根据非小细胞肺癌分子残留病灶专家共识，mrd检测在肺癌中的应用主要有三方面。第一方面，可手术早期非小细胞肺癌(nsclc)mrd的应用，包括：(1)早期nsclc患者根治性切除术后，mrd阳性提示复发风险高，需进行密切随访管理，建议每3～6个月进行一次mrd检测；(2)建议基于mrd开展可手术nsclc的围术期临床试验，尽可能提供围术期精准治疗方案；(3)建议分别探索mrd在驱动基因阳性和驱动基因阴性两种类型患者中的作用。第二方面，局部晚期nsclc mrd的应用，包括：(1)局部晚期nsclc根治性化放疗后完全缓解患者，建议检测mrd，有助于判断预后和制定进一步的治疗策略；(2)建议开展基于mrd的化放疗巩固治疗的临床试验，尽可能提供精准的巩固治疗方案。第三方面，晚期nsclc mrd的应用，包括：(1)晚期nsclc系统治疗后完全缓解患者，建议检测mrd，有助于判断预后和制定进一步的治疗策略；(2)建议在完全缓解患者中开展基于mrd的治疗策略研究，尽可能延长完全缓解时间，使患者能最大获益。

3、可见，肺癌mrd检测具有巨大的临床应用前景，它不仅能及早发现复发高风险患者，进而及早干预治疗，争取治愈更多患者，减少复发、转移，改善预后，还能甄别肺癌术后/辅助治疗后复发低风险患者，避免过度治疗所导致的相关风险，给患者一个真正的无治疗假期。总的来说，肺癌mrd检测的用途在于预测肺癌复发风险、指导辅助治疗、疗效预测、判断患者是否可进入无治疗假期、判断患者体内的肿瘤负荷等，最终助力肺癌精准诊疗。

4、目前肺癌mrd检测主要是通过cfdna-mrd检测来实现的，其常用检测方法是基于杂交捕获的靶向高通量测序(ngs)。该方法是通过捕获探针与基因组中特定区域杂交，从而获得目的区域的序列并进行分析的方法，可检测点突变、小片段的插入缺失和拷贝数变异，以及dna层面的基因重排，且可以发现一些未知融合，检测灵敏度可达95％以上。但是，由于该方法操作步骤多，过程相对复杂，难免会引入一些背景噪音，致使cfdna-mrd检测中的低频突变往往淹没在背景噪音之中，造成假阴性或假阳性结果，影响了cfdna-mrd检测的灵敏度和特异性。因此，如何解决基于杂交捕获的靶向ngs方法的背景干扰问题，成为目前肺癌mrd检测所面临的挑战。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的在于提供一种肺癌mrd检测用捕获探针池和检测试剂盒，所述检测试剂盒采用针对16个肺癌相关基因精心设计的捕获探针池、优化的杂交液配方，对肺癌患者血浆样本cfdna进行基于杂交捕获的靶向ngs，可有效降低背景干扰，具有良好的检测灵敏度和特异性，能够很好地实现肺癌mrd检测。

2、实现上述目的的技术方案包括如下。

3、本发明的第一个方面，是提供一种肺癌mrd检测用捕获探针池，所述捕获探针池由针对至少一种目标基因的正链捕获探针和负链捕获探针组成，每种目标基因的捕获探针根据目标基因的正链和负链核苷酸序列依次设计、呈交错排列，能够覆盖全部目标基因序列；所述正链和负链捕获探针中，相邻的两个探针，一个为正链捕获探针，另一个则为负链捕获探针，且所针对的目标基因序列没有重叠；所述目标基因选自以下16种中的至少一种：alk、braf、egfr、her2、kras、met、nras、mek1、pik3ca、ret、ros1、tp53、ntrk1、ntrk2、ntrk3和pd-l1。

4、在其中一些实施例中，所述捕获探针池中捕获探针的5’端均经过修饰，所述修饰的方法为生物素(biotin)标记。

5、在其中一些实施例中，所述捕获探针池中捕获探针的长度为80～130bp；优选地，所述捕获探针池中捕获探针的长度为100～110bp。

6、在其中一些实施例中，所述捕获探针池中目标基因的正链捕获探针和负链捕获探针选自以下至少一组：

7、序列如seq id no.1～seq id no.30所示的针对alk基因的捕获探针；

8、序列如seq id no.31～seq id no.40所示的针对braf基因的捕获探针；

9、序列如seq id no.41～seq id no.64所示的针对egfr基因的捕获探针；

10、序列如seq id no.65～seq id no.80所示的针对her2基因的捕获探针；

11、序列如seq id no.81～seq id no.86所示的针对kras基因的捕获探针；

12、序列如seq id no.87～seq id no.110所示的针对met基因的捕获探针；

13、序列如seq id no.111～seq id no.116所示的针对nras基因的捕获探针；

14、序列如seq id no.117～seq id no.128所示的针对mek1基因的捕获探针；

15、序列如seq id no.129～seq id no.140所示的针对pik3ca基因的捕获探针；

16、序列如seq id no.141～seq id no.160所示的针对ret基因的捕获探针；

17、序列如seq id no.161～seq id no.180所示的针对ros1基因的捕获探针；

18、序列如seq id no.181～seq id no.192所示的针对tp53基因的捕获探针；

19、序列如seq id no.193～seq id no.212所示的针对ntrk1基因的捕获探针；

20、序列如seq id no.213～seq id no.224所示的针对ntrk2基因的捕获探针；

21、序列如seq id no.225～seq id no.238所示的针对ntrk3基因的捕获探针；

22、序列如seq id no.239～seq id no.248所示的针对pd-l1基因的捕获探针。

23、本发明的第二个方面，是提供了一种用于上述捕获探针池杂交捕获的杂交液，所述杂交液包含300～600mm磷酸钠缓冲液(ph值7.0)、10％～50％(v/v)的2×ssc(ph值7.0)、0.5％～1.5％(w/v)的sds、1％～3％(v/v)的denhardt溶液、1％～5％(w/v)的硫酸葡聚糖、1％～10％(w/v)的海藻糖、0.1％～0.5％(v/v)的tween-20。

24、在其中一些实施例中，所述杂交液包含400～500mm磷酸钠缓冲液(ph值7.0)、20％～40％(v/v)的2×ssc(ph值7.0)、0.8％～1.2％(w/v)的sds、1.5％～2.5％(v/v)的denhardt溶液、2％～4％(w/v)的硫酸葡聚糖、4％～7％(w/v)的海藻糖、0.2％～0.4％(v/v)的tween-20。

25、在其中一些优选的实施例中，所述杂交液包含450mm磷酸钠缓冲液(ph值7.0)、30％(v/v)的2×ssc(ph值7.0)、1％(w/v)的sds、2％(v/v)的denhardt溶液、3％(w/v)的硫酸葡聚糖、5.5％(w/v)的海藻糖、0.3％(v/v)的tween-20。

26、在其中一些实施例中，所述杂交液的ph值为6.8～7.2。

27、在其中一些优选的实施例中，所述杂交液的ph值为7.0。

28、本发明的第三个方面，是提供了一种肺癌mrd检测试剂盒，其包括如上所述杂交液和捕获探针池；其中，所述捕获探针池为如上所述肺癌mrd检测用捕获探针池中每种捕获探针以相同的摩尔比混合并稀释至使用浓度而成。

29、在其中一些实施例中，所述每种捕获探针的使用浓度为0.1pm～6pm。

30、在其中一些优选的实施例中，所述每种捕获探针的使用浓度为1pm～2pm；更优选为1.4pm～1.6pm。

31、本发明的第四个方面，是提供了一种肺癌mrd检测方法，主要包括以下步骤：

32、s1、血浆cfdna提取：采集受试者血液样本，离心分离血浆，使用市售血浆cfdna提取试剂盒按照其产品说明书提取血浆cfdna样本；

33、s2、构建文库：使用市售文库构建试剂盒按照其产品说明书对提取的血浆cfdna样本进行文库构建；

34、s3、杂交捕获：使用如上所述本发明的肺癌mrd检测试剂盒进行杂交，捕获目的片段；

35、s4、上机测序与数据分析。

36、在其中一些实施例中，所述杂交捕获步骤中，杂交时间为1～16小时；优选地，杂交时间为1.5～2.5小时。

37、本发明提供了一种肺癌mrd检测用捕获探针池，所述捕获探针池由针对至少一种目标基因的正链捕获探针和负链捕获探针组成，所述目标基因选自以下16种中的至少一种：alk、braf、egfr、her2、kras、met、nras、mek1、pik3ca、ret、ros1、tp53、ntrk1、ntrk2、ntrk3和pd-l1，所述捕获探针采用正、负链探针交错分布的设计，每种目标基因的捕获探针根据目标基因的正链和负链核苷酸序列依次设计、呈交错排列，且覆盖全部目标基因序列，不仅避免了因探针间的相互杂交导致的探针利用率低、捕获效率低、背景噪音高等问题，而且可同时捕获文库中目标基因的正、负链两条链，提高了文库丰度，增加了捕获探针与文库中目标基因序列杂交的机会，从而提高了杂交捕获效率。

38、本发明还提供了一种杂交液，所述杂交液的使用不仅可以有效地缩短杂交捕获时间，节约了时间成本，而且可以在增强目标基因杂交信号的同时降低非特异性背景噪音，从而很好地控制杂交时产生的背景值，提高杂交捕获效果。

39、本发明提供了一种肺癌mrd检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒具有良好的检测灵敏度和特异性，且背景低、杂交捕获时间短，可有效检出alk、braf、egfr、her2、kras、met、nras、mek1、pik3ca、ret、ros1、tp53、ntrk1、ntrk2、ntrk3和pd-l1共16个肺癌相关基因的基因突变(点突变/插入/缺失)、基因融合、基因拷贝数变异等多种变异类型，能够很好地实现肺癌mrd检测。