检测败血症相关病原体的组合物、试剂盒及用途的制作方法

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及败血症相关病原体的检测，更具体地，涉及咽峡炎链球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌。

背景技术：

1、嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)属于黄单胞菌目的黄单胞菌科，是一种广泛存在于自然界和医院环境中的革兰阴性条件致病菌。随着广谱抗菌药物、免疫抑制剂的广泛应用，以及侵袭性操作的不断增多，其分离率在非发酵菌属中呈上升趋势。由于致病力较弱，其感染常发生在免疫力低下、病情危重的患者，通常为医院感染，社区很少发生感染。此外，该菌对多种抗菌药物固有耐药，给临床抗感染治疗和感染防控带来挑战。最常见的感染类型为下呼吸道感染，还可引起血流、泌尿系、腹腔、皮肤和软组织等部位的感染。另外嗜麦芽窄食单胞菌常和其它条件致病菌形成混合感染。嗜麦芽窄食单胞菌引起的感染可发生在儿童和成人中，特别是在免疫功能低下的患者群体中。感染的危险因素包括：恶性肿瘤、留置中心静脉导管、慢性呼吸道疾病、免疫功能低下、低蛋白血症、既往长期接受广谱抗菌药物治疗和住院时间长(尤其是icu)等。直接接触是其主要的传播方式，医务人员的手是最常见的传播媒介，可通过人与人、人与物体表面的接触使易感人群感染。

2、咽峡炎链球菌(streptococcus anginosus)是定植在口腔、咽喉、消化道等正常菌群之一，是米勒链球菌群其中之一。咽峡炎链球菌是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的兼性厌氧球菌，在琼脂培养基上形成小菌落，属于草绿色链球菌群。咽峡炎链球菌所致疾病最常见为呼吸道感染、化脓性感染以及血流感染，分别占比34.8％、33.5％、8.5％。既往研究证实，咽峡炎链球菌可产生多种体外毒素，多引起侵袭性化脓性感染，一旦入侵血液后可随血液循环遍及全身，引起全身严重感染性疾病。咽峡炎链球菌群血流感染患者大多与侵袭性操作有关，咽峡炎链球菌血流感染临床特征，多数患者合并一些基础疾病，如消化系统、心血管系统、呼吸系统疾病及肿瘤。多项研究表明，咽峡炎链球菌群血流感染中最常见的基础疾病为肿瘤，推测肿瘤引起的占位性病变破坏人体正常结构引起局部感染，进而引起咽峡炎链球菌群感染。咽峡炎链球菌感染特征不明显，鉴定难度大，临床工作中，若疑为相关细菌感染时应及时送检标本，及时根据药敏结果合理应用抗生素，进行耐药性监测，以提高预后。关于咽峡炎链球菌的鉴定,大多数国家采用自动鉴定仪和api 20strep试剂盒等。国内只有少数大医院采用上述方法,就是用这种方法也不能100％的做出正确鉴定,但仍然是临床实验室的主要鉴定方法。

3、金黄色葡萄球菌(staphyloccocus aureus rosenbach)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(staphylococcus)，可引起多种严重感染。有“嗜肉菌"的别称。典型的金黄色葡萄球菌为球型，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死；杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关；脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌；肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为a、b、c1、c2、c3、d、e及f八种血清型。肠毒素可耐受100℃煮沸30分钟而不被破坏。它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。

4、粪肠球菌(enterococcus faecalis)为肠球菌属中的一种革兰氏阳性兼性厌氧菌。该菌作为人类肠道中的正常优势菌群，具有维持正常肠道菌群结构的重要作用，在肠黏膜具有较强的耐受和定植能力。同时，粪肠球菌也是常见的条件致病菌，致病性粪肠球菌引起的感染有尿路感染、化脓性腹部感染、败血症、心内膜炎、腹泻和发烧等。此外，粪肠球菌对环境适应力和抵抗性强，可耐受四环素、卡那霉素、庆大霉素等多种抗生素。粪肠球菌可引起医源感染，最常见的为尿道器械操作、导尿等引起的尿道感染，其次为腹腔和盆腔等部位的创伤和外科术后感染。由于粪肠球菌细胞壁厚，与其他病原菌相比，其特殊生物性特性更容易出现耐药性，且近年来粪肠球菌引起的感染呈上升趋势，出现耐药性转移现象，因此鉴于粪肠球菌潜在的致病风险，早期及时诊断病原体感染具有重要意义。

5、败血症(wound infection)是指存在足够数量或毒性的微生物，在宿主中引起局部或全身反应，包括持续疼痛、红热、大量渗出物、伤口床黄色腐肉>50％、肉芽组织变色、组织脆弱性增加、易出血、气味或坏死组织。伤口中微生物的存在会延迟伤口愈合，并增加截肢和死亡的风险。有效的预防、诊断和治疗策略对于降低与败血症相关的死亡率和发病率至关重要。

6、因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述病原体，并且灵敏度高，特异性好，为临床医生提供较为充分的快速诊断以及排除不同病原体感染的依据，缩短临床医生对患者病情诊断的时间，加快对患者实施治疗措施。

技术实现思路

1、有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测败血症相关病原体的组合物，包括：

2、如seq id no:1～3所示的检测咽峡炎链球菌的上游引物、下游引物及探针；

3、如seq id no:4～6所示的检测嗜麦芽窄食单胞菌的上游引物、下游引物及探针；

4、如seq id no:7～9所示的检测金黄色葡萄球菌的上游引物、下游引物及探针；以及

5、如seq id no:10～12所示的检测粪肠球菌的上游引物、下游引物及探针。

6、本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光pcr分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实咽峡炎链球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌，和粪肠球菌的检测和区分，以便为后续治疗提供针对性策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到500拷贝/ml，特异性好，检测更为准确，为临床医生提供较为充分的快速诊断以及排除不同病原体感染的依据，缩短临床医生对患者病情诊断的时间，加快对患者实施治疗措施。

7、进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。

8、在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是rnase p。

9、进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

10、在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用atto425、quasar705、fam、hex、rox和cy5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。

11、在一些具体的实施方案中，咽峡炎链球菌探针的荧光报告基团为fam；嗜麦芽窄食单胞菌探针的荧光报告基团为hex(或vic)；金黄色葡萄球菌探针的荧光报告基团为rox；粪肠球菌探针的荧光报告基团为cy5。

12、进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。

13、本发明的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。

14、举例来说，可以包括上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。

15、在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光pcr。

16、进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。

17、进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如bhq1或bhq2。

18、在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为bhq1。

19、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。

20、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。

21、进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。

22、第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测败血症相关病原体的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为咽峡炎链球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌和/或粪肠球菌。

23、第三方面，本发明提供了一种检测败血症相关病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。

24、进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。

25、在一个具体的实施方案中，阴性质控品是depc h2o、生理盐水中的至少一种。阳性质控品是咽峡炎链球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的片段质粒或阳性菌株中的至少一种。

26、进一步地，所述试剂盒还包括dntp、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。

27、更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂，以及dna聚合酶中的至少一种。

28、更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dntp、dutp、尿嘧啶糖基化酶(udg)、dna聚合酶、pcr缓冲液以及mg2+中的至少一种。

29、进一步地，所述dna聚合酶的浓度为3u/反应～15u/反应，例如dna聚合酶可以是taq酶。

30、在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括taq酶、udg酶、mg2+、dntp(u)s、引物、探针和pcr缓冲液。

31、常见的pcr缓冲液由tris-hcl、mgcl2、kcl、triton x-100等缓冲体系构成。一般单个pcr反应管中总体积为20μl～200μl。

32、在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字pcr扩增体系，即可以直接用于数字pcr仪上进行扩增。

33、第四方面，提供了一种用于非诊断目的的检测败血症相关病原体的方法，所述方法包括以下步骤：

34、1)提取待测样本的核酸；

35、2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；

36、3)获得并分析结果。

37、在本发明中，用于检测的样本可以是血液、组织液等，但不限于此。

38、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

39、预变性，温度为90～95℃，时间为1～6min，1次循环；变性，温度为90～95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

40、在一个具体的实施方案中，提供了一种组合物用于制备检测败血症相关病原体的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：

41、1)提取待测样本的核酸；

42、2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr；

43、3)获得并分析结果。

44、进一步地，所述荧光定量pcr的反应条件为：

45、预变性，温度为90～95℃，时间为1～6min，1次循环；变性，温度为90～95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。

46、在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染上述病原体并罹患败血症的信息。例如，该方法可以在培养物中(例如血液、组织液等)需求检测是否有上述病原体。