T细胞表位疫苗及其设计方法

本发明涉及基因工程领域和疫苗开发领域，具体地说，本发明提供了t细胞表位疫苗及其设计方法。

背景技术：

1、传统疫苗开发依赖于通过试错积累数据和经验，缺乏对疾病免疫保护机制的深入认识。近年来，随着免疫学研究的发展，新的研究方法不断涌现，对抗感染免疫保护机制的阐释日渐清晰，而对免疫学机制的深入认识反过来也促进了疫苗研发的进步。基于生物信息学预测的t细胞表位疫苗设计便是其中一种新型疫苗开发策略。表位疫苗去除了全长蛋白或全病原体中的非必需序列，降低了副作用，同时聚集了优势表位，更精准地诱导特异性免疫应答。目前，基于生物信息学设计的t细胞表位疫苗设计策略已在艾滋病、结核病、流感和肿瘤等疫苗的研究中得到了初步应用。

2、现有的t细胞疫苗设计方案是利用抗原表位或抗原蛋白构建疫苗，以期相应地的激活cd8+t细胞应答或cd4+t细胞应答，然而引起免疫应答不够高效。

3、因此，本领域迫切需要开发能高效地同时激活相应的表位特异性cd4+t细胞和cd8+t细胞免疫应答并且能增强免疫性能的疫苗。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供高效地同时激活相应的表位特异性cd4+t细胞和cd8+t细胞免疫应答并且具有增强的免疫性能的疫苗。

2、本发明的另一目的在于提供一种设计t细胞表位疫苗的方法。

3、在本发明的第一方面，提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物包含串联的编码mhc-i/ii复合表位肽的核酸序列，其中各个mhc-i/ii复合表位肽为包含了mhc-i表位序列的mhc-ii的表位肽。

4、在另一优选例中，所述的核酸构建物编码m种不同的mhc-i/ii复合表位肽，m为≥3的正整数，较佳地m≥5，更佳地≥10，最佳地≥15。

5、在另一优选例中，所述的各个mhc-i/ii复合表位肽包含一个mhc-i表位序列和一个mhc-ii表位序列。

6、在另一优选例中，所述核酸构建物还包含串联的编码额外抗原肽的核酸序列。

7、在另一优选例中，所述的额外抗原肽包括b细胞表位肽。

8、在另一优选例中，在两个相邻的mhc-i/ii复合表位肽编码序列之间，设有连接子的编码序列，所述连接子包含可酶解位点。

9、在另一优选例中，所述核酸序列编码如式i所示的表位复合多肽

10、z0-[z1-l1]n-z2……(i)

11、式中，

12、z0为无或信号肽；

13、z1各自独立地为mhc-i/ii复合表位肽序列；

14、l1为连接子，所述连接子包含可酶解位点；

15、z2为无或mhc-i/ii复合表位肽序列；

16、n为≥1的正整数；

17、“-”为肽键。

18、在另一优选例中，其中z1的长度为12到22个氨基酸，较佳地为12到18个氨基酸，更佳地为13-16个氨基酸。

19、在另一优选例中，所述的核酸序列包含一个或多个结构如式ii的编码序列单元：

20、-[y1-y2]-……(ii)

21、其中，

22、y1为编码mhc-i/ii复合表位肽序列的核酸序列；

23、y2为编码连接子的核酸序列；

24、“-”为磷酸二酯键。

25、在另一优选例中，在两个相邻的y1之间通过所述y2连接。

26、在另一优选例中，所述连接子包含蛋白酶的酶切位点。

27、在另一优选例中，所述连接子选自下组：kk、胰蛋白酶的酶切位点、羧肽酶的酶切位点、氨肽酶酶切位点、或其组合。

28、在另一优选例中，所述核酸构建物中的连接子是kk。

29、在另一优选例中，所述核酸序列包含至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少99％或100％表达mhc-i/ii复合表位的编码序列。

30、在另一优选例中，所述的核酸构建物选自下组：dna构建物、rna构建物、或其组合。

31、在另一优选例中，所述表位复合多肽包含选自seq id nos:1-88所示的序列。

32、在另一优选例中，所述表位复合多肽包含至少3种，较佳地至少5种，更佳地至少10种，最佳地至少15种选自seq id nos:1-19中的序列。

33、在另一优选例中，所述表位复合多肽包含至少3种，较佳地至少5种，更佳地至少10种，最佳地至少15种选自seq id nos:20-40中的序列。

34、在另一优选例中，所述表位复合多肽包含至少3种，较佳地至少5种，更佳地至少7种，最佳地至少9种选自seq id nos:41-50中的序列。

35、在另一优选例中，所述表位复合多肽包含至少3种，较佳地至少5种，更佳地至少10种，最佳地至少12种选自seq id nos:51-73中的序列。

36、在另一优选例中，所述表位复合多肽包含至少3种，较佳地至少5种，更佳地至少10种，最佳地至少15种选自seq id nos:74-88中的序列。

37、在另一优选例中，所述表位复合多肽包含来自一种或多种不同病原体的表位复合多肽，如将来自以下至少两种不同病原体的表位复合多肽串联所形成的多肽：结核杆菌、新冠病毒、流感病毒、白色念球菌、乙肝病毒、或其他病原体。

38、在另一优选例中，所述表位复合多肽包含来自一种或多种不同肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的表位复合多肽。

39、在另一优选例中，所述核酸构建物还包含位于式i所示的编码序列上游或下游的选自下述的元件：信号肽、转录起始序列、启动子、标签序列(如6his标签序列)、终止子、酶切位点序列。

40、在另一优选例中，所述核酸构建物进一步包含位于式i所示的编码序列上游或下游的下述元件：

41、nhei酶切位点序列、kozak序列、启动子、标签序列(如6his标签序列)、终止子、bamhi酶切位点序列。

42、在本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含由本发明第一方面所述的核酸构建物所编码的氨基酸序列。

43、在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体包含本发明第一方面所述的核酸构建物。

44、在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的核酸构建物或本发明第二方面所述的融合蛋白或本发明第三方面所述的载体。

45、在本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的核酸构建物或本发明第二方面所述的融合蛋白或本发明第三方面所述的载体在制备药物组合物中的用途。

46、在另一优选例中，所述药物组合物为疫苗组合物。

47、在本发明的第六方面，提供了设计t细胞表位疫苗的方法，包括：

48、a)提供疫苗所针对病原体或抗原的全基因组的蛋白序列或其编码序列；

49、b)基于生物信息学分析，从所述病原体的蛋白序列或其编码序列预测的蛋白序列中筛选出所述病原体所特有的mhc-i/ii复合表位肽序列；

50、c)基于筛选出的mhc-i/ii复合表位肽序列，设计包含所述mhc-i/ii复合表位肽序列的表位复合多肽；优选地，所述表位复合多肽包含串联的多个不同的mhc-i/ii复合表位肽序列；

51、d)任选地基于所述表位复合多肽设计其编码序列。

52、在另一优选例中，所述的表位复合多肽具有上述式i所示的结构。

53、在另一优选例中，所述表位复合多肽包含a种不同的mhc-i/ii复合表位肽序列，a为≥3的正整数，较佳地a≥5，更佳地≥10，最佳地≥15。

54、在另一优选例中，在所述表位复合多肽中两个相邻的mhc-i/ii复合表位肽序列之间，设有连接子的序列，并且所述连接子包含可酶解位点。

55、在另一优选例中，所述连接子选自下组：kk、或任选地可在体内酶解的序列。

56、在另一优选例中，所述方法针对一种或多种不同的病原体。

57、在另一优选例中，所述病原体选自病毒、细菌、真菌，或其组合。

58、在另一优选例中，所述抗原选自肿瘤新生抗原、肿瘤相关抗原，或其组合。

59、在另一优选例中，所述病毒选自人类免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒疫苗、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、冠状病毒、黄热病毒、轮状病毒，或其组合。

60、在另一优选例中，所述细菌选自结核分枝杆菌、脑膜炎球菌、流感嗜血杆菌、白色念珠菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌，或其组合。

61、在另一优选例中，所述真菌选自念珠菌、曲霉病、隐球菌、肺孢子菌、曲霉菌、接合菌，或其组合。

62、在另一优选例中，所述蛋白选自衣壳蛋白、外壳蛋白、分泌蛋白、膜蛋白、细胞壁蛋白，或其组合。

63、在另一优选例中，所述病原体选自下组:结核分枝杆菌、新冠病毒、流感病毒、白色念球菌、或其组合。

64、在另一优选例中，所述病原体为结核分枝杆菌或结核分枝杆菌复合群。

65、在另一优选例中，所述肿瘤相关抗原或肿瘤新生抗原选自下组：her2、cdca1、ly6k、imp3、scm或其组合，但不仅限于这几个蛋白。

66、在另一优选例中，所述的表位复合多肽具有上述式i所示的结构。

67、在另一优选例中，所述方法还包括验证所述表位复合多肽或其编码序列编码的表位复合多肽能否表达和/或能否被切割。

68、在另一优选例中，所述方法还包括验证所述表位复合多肽或其编码序列编码的表位复合多肽的免疫原性。

69、在另一优选例中，所述的验证在体外进行。

70、在本发明的第七方面，提供了一种预防或治疗疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的核酸构建物、本发明第二方面所述的融合蛋白、本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的药物组合物。

71、在另一优选例中，所述疾病包括病原体引起的疾病。

72、在另一优选例中，所述病原体包括病毒、细菌、真菌。

73、在另一优选例中，所述疾病包括艾滋病、结核病、流感和肿瘤等相关疾病。

74、在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。

75、在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括非人灵长动物(如猴)。

76、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。