一种在受精卵期导入特异mRNA制作GHR-KO微型猪的方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种在受精卵期导入特异mrna制作ghr-ko微型猪的方法。

背景技术：

1、猪的心血管系统、消化系统、皮肤、骨骼以及代谢等生物学功能特征等都与人体非常相近，猪的体型大小和习性允许科研工作者对其进行反复采样和各种外科手术；并且，与非人灵长类动物相比，猪具有基因多样性、繁殖周期短、一窝多产等特点。所以，以猪作为模式生物对象，有利于实现人们特殊研究需求，如用于做药物筛选、人类疾病研究、干细胞治疗等研究，其研究数据、结果也更接近临床。

2、crispr/cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源dna。crispr/cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒dna的片段整合到crispr中，并利用相应的crispr rnas(crrnas)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。后来，研究人员发现，它更是一种精确且万能基因编辑工具，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，包括人、老鼠、猪、牛等多种动物的基因。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如条件性基因敲除、基因插入、基因替换或定点突变等。crispr/cas9技术以其操作的便捷性、基因编辑能力的高效性获得广大研究者的青睐，该技术面世以后，弥补了传统基因编辑技术的诸多不足，在基因编辑领域有着广阔的应用前景。

3、脑垂体合成并分泌的生长激素(gh)不仅控制机体生长发育，还在许多代谢疾病中起关键调控作用。gh通过与其表面受体(ghr)结合而启动其生物学功能，基于分子生物学技术构建各种ghr敲除动物，成为揭示gh调控机制的基础研究方法和材料。

4、本发明首次在受精卵中显微注射靶向敲除ghr的grna和crispr/cas9mrna，成功制作ghr-ko微型猪。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种在受精卵期导入特异mrna制作ghr-ko微型猪的方法，所述方法为：

2、(1)根据猪ghr基因序列，设计靶向敲除猪ghr第6外显子的grna；

3、(2)然后体外制备、纯化grna和crispr/cas9 mrna，并利用显微注射技术将其导入微型猪受精卵中；

4、(3)把注射成功的受精卵移入受体母猪体内完成妊娠，通过对出生猪仔ghr基因型鉴定，获得敲除ghr基因的微型猪个体。

5、更具体的，本发明利用crispr/cas9编辑工具敲除藏香猪ghr基因，破坏gh受体，敲除16号染色体ghr基因第6个外显子dna片段(ghr基因的第6个外显子的核苷酸序列如seqid no.1所示)。

6、ghr-exon6为：

7、atggaccctgtattgtcaacatcagttccggtgtactccttgagactggataaagagtatgaagtgcgtgtgagatccagacaacgaaactctgaaaaatatggagagttcagtgaagtgctgtatgtaacacttcctcagatgagcccatttgcatgtgaagaag(seq id no.1)

8、为了实现本发明目的，本发明中设计并合成了靶向ghr基因的特异性grna，构建到能表达cas9蛋白的crr载体上，形成能够特异性识别ghr基因并对识别位点进行打靶的crispr/cas9系统。通过分子克隆方法转染并提取质粒，于体外转录获取mrna。再通过显微胞质注射受精卵和受体代孕方法获得ghr-ko微型猪个体。

9、优选地，所述微型猪为五指山猪、版纳小耳猪、巴马香猪、藏香猪、荷包猪、乌金猪中的一种，也可包括其他类型的微型猪品种。

10、更优选地，所述所述微型猪为藏香猪。

11、优选地，步骤(1)中，所述靶向敲除猪ghr的grna序列为：5’-ccggtgtactccttgagactgga-3’。(seq id no.2)

12、基于相同的技术构思，本发明还提供一种上述方法得到的微型猪在科研和医学中的应用。所获得ghr-ko微型猪为研究猪ghr基因生理功能以及人类侏儒症分子机理提供了重要模型。相比传统基因打靶、体细胞克隆，本技术方法具备更简捷、快速，更易于在生物医学和农业基因靶向修饰研究中推广。

13、本发明上述步骤中，利用ncbi网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找目的基因序列(gene id:397488)。

14、本发明上述步骤中，通过crispr/cas9基因编辑工具，构建ghr-cas9共表达载体。

15、本发明上述步骤中，连接骨架反应体系为：t4 buffer 1μl、crr骨架1μl、grna 2μl、t4 ligase 0.5μl、水5.5μl，于16℃，连接时间为4小时。

16、本发明上述步骤中，利用共表达载体与质粒共转染体细胞，经体细胞体外培养扩繁后提取体细胞dna，t7酶切鉴定其载体活性，并在体外转录成mrna。

17、本发明上述步骤中，菌液测序时，上、下游引物序列分别是：

18、ghr-ko-测序-f：cctttcttgaaatagc(seq id no.3)；

19、ghr-ko-测序-r：atctggacaacaccc(seq id no.4)。

20、本发明上述步骤中，细胞转染活性鉴定时，鉴定上、下游引物序列分别是：

21、ghr-iden-f：ctgacagcctaatacaaag(seq id no.5)；

22、ghr-iden-r：ttacgccacatctaaaca(seq id no.6)。

23、本发明上述步骤中，脂质体转染时，crr质粒与cas9质量比为3:2。

24、本发明上述步骤中，在配种后31小时进行冲胚。

25、本发明上述步骤中，配种方式为本交，冲胚方式是从子宫角往输卵管伞部方向进行冲洗。

26、本发明上述步骤中，开放式手术法冲胚，冲胚液组成成分为pbs+5％fbs，冲胚液的使用量为30毫升。

27、本发明上述步骤中，注射方法为胞质内注射，注射内容物为mrna，注射浓度为100纳克/微升。

28、本发明上述步骤中，利用显微注射仪对藏香猪受精卵胞质注射mrna，对注射成功卵子回移受体母猪体内完成妊娠。

29、本发明上述步骤中，胚胎移植导管为市售猫用导尿管，如图4所示。

30、本发明上述步骤中，注射后的受精卵移植部位为同期发情受体输卵管壶腹部，如图4所示。

31、本发明上述步骤中，妊娠期满114天后得到ghr-ko基因编辑微型猪。

32、本发明的有益效果为：

33、本发明所构建的基于crispr/cas9系统的ghr敲除载体是一种有效、快捷的技术方法，该方法导入mrna而非传统dna分子，可以避免ghr敲除小型猪出现嵌合体的弊端，大大提高获得超小型、小型猪的效率，大幅度缩减经费支出。另外，得到的超小型、小型猪也将为后续研究者开展动物生长发育机制研究和小型猪疾病模型的创制提供重要材料。