一种以脐带间充质干细胞制备方法与流程

本发明涉及干细胞制备方法，具体为一种以脐带间充质干细胞制备方法。

背景技术：

1、一些干细胞不仅具有多向分化潜能，而且易于外源基因的转染和表达。将体外经过基因修饰的干细胞用于治疗，可以避免转染载体进入受体产生的不良影响。基因修饰的干细胞可以在多个靶位发挥作用；干细胞潜能的改变，干细胞靶位基因转染以后可以改变干细胞的某些特性。从成人或成年动物分离的干细胞有时会表现出年龄相关性、遗传性或获得性疾病相关性再生能力损伤，基因转录或酶切修饰可以有效地维持、加强或抑制干细胞的分化和增殖能力；器官系统性能的改善，干细胞子代靶位转入干细胞的基因可以随着干细胞的分化传代而遗传给子代细胞，在基因转导的干细胞重建的器官系统中持续表达，改善重建器官系统的功能；加速损伤组织的再生，再生过程靶位损伤组织的修复是通过于细胞的扩增和分化来完成的。如内皮祖细胞完成血管的重建，神经干细胞完成神经的再生，造血干细胞和间充质干细胞完成骨髓的重建等。由于损伤严重、疾病和年龄因素的影响，自然的修复过程往往比较缓慢。经过基因修饰使于细胞增加丝裂源特性或产生抑制负调控的因子，可加速组织再生过程；产生外源基因表达的组织，系统靶位基因修饰的干细胞植入体内，产生有修饰基因持续表达的替代组织或器官，进而提供一定数量的用于治疗的靶分子。目前已发现脐带间充质干细胞可以治疗包括人体神经系统、免疫系统、消化系统、运动系统等系统的80多种疾病，脐带间充质干细胞在人体抗衰老方面的研究也已取得重大突破并已进行应用尝试，有专家预测，干细胞抗衰老技术的广泛应用，将使人类的寿命在2050年普遍达到120岁以上。脐带间充质干细胞作为重要的再生医学资源在疾病治疗和人体抗衰老的应用领域有非常重要的使用价值，但由于脐带间充质干细胞仅存在于脐带中，如果脐带被当作医疗废弃物丢掉，则脐带间充质干细胞这一异常珍贵的再生医学资源也将随之浪费且无法补救。因此，非常有必要将这一宝贵的再生医学资源及时保存起来以便将来使用。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题在于克服现有技术的提供一种以脐带间充质干细胞制备方法。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种以脐带间充质干细胞制备方法，包括充质干细胞制备方法,步骤如下：

3、s1.制备：使用生理盐水充分洗涤脐带，并剪成小段；去除动脉和静脉，撕取华通胶至少8ml；充分剪碎后平分至4瓶已加25ml完全培养基的175cm2培养瓶中；静置培养7天；第8天根据生长情况，进行换液、传代；

4、s2.换液：根据细胞生长情况与培养基颜色决定全量换液或半量换液；用去头移液管吸弃半量或全量旧培养基，更换移液管，于培养瓶的非细胞培养面缓慢加入等量新培养基；

5、s3.传代：每瓶加0.25％胰酶3ml，待细胞变圆后轻拍瓶壁，每瓶加终止液(2％fbs+a-mem)10ml，吸出细胞悬液至2支50ml离心管中，各培养瓶每瓶加10ml生理盐水，吹洗汇入50ml离心管中；1200rpm，离心6min，弃上清；合并沉淀至1管，加40ml生理盐水再次离心洗涤，沉淀用10ml完全培养基重悬，经细胞筛过滤，5ml完全培养基冲洗筛网，计数；根据细胞数量铺瓶，使细胞浓度为1～2×104/ml，置37℃、5％co2培养箱中培养；

6、s4.收获：每瓶加入3ml0.25％胰酶，37℃消化1min，加入终止液10ml/瓶，收集所有液体到50ml离心管中，再每瓶加10ml生理盐水，轻柔吹打后汇入50ml离心管中；1200转/min离心6min，弃上清，细胞沉淀用16ml生理盐水悬浮，混匀取1ml做计数和流式检测；加生理盐水至40ml，取500μl上清做内毒素检测，1200rpm，离心6min；弃上清，离心沉淀用2.5mlfbs悬浮，再缓慢加入2.5ml冻存母液，混匀后分装到冻存管中，每管1ml；冻存细胞数应控制在2～5×106/ml范围内；利用程序降温盒放置-80℃医用冰箱中过夜后转至液氮罐。

7、优选的，脐带间充质干细胞的分离步骤如下：

8、s1.脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4℃保存，在操净台内取出脐带，用d-pbs冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块后放入200ml蓝盖试剂瓶，加入质量/体积比为0.1％的ⅱ型胶原酶30ml，置于恒温振荡仪内持续消化6h，100目筛网过滤收集细胞；加入d-hank’s液冲洗细胞3次，用含体积分数为10％胎牛血清的dmem/f12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3～1×10^4)/cm^2，接种于6孔板内，于37℃、体积分数为5％的co2孵箱内培养，24h后换液；

9、s2.脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6孔板中进行3种培养体系的生长对比实验；第1个6孔板中细胞密度为1×10^7l^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的dmem/f12分别逐步过渡到低糖dmem、mesenprorstmmedium和mscsfm3种培养体系，即用含体积分数为10％胎牛血清的dmem/f12培养基和相应的3种培养基按体积比1∶1混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔1为原代培养时的dmem/f12培养液，孔2为低糖dmem，孔3为mesenprorstmmedium，孔4为mscsfm；第2个6孔板中细胞密度为2×10^7l^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差；

10、脐带间充质干细胞的体外分离培养：

11、(1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0.9％生理盐水中，4"c保存；

12、(2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块；

13、(3)加入质量/体积比为0.1％的ii型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化6h，100目筛网过滤收集细胞；

14、(4)生理盐水冲洗细胞3次，每次2000rpm，8min；

15、(5)用含10％fbs的dmem/f12培养液重悬细胞，调整细胞密度为1x106cells/ml，接种于t.25培养瓶中，置于37；c、饱和湿度、5％c02培养箱内培养；

16、(6)3天后全量换为mesenprorsrmmedium培养液，弃去未贴壁的细胞与杂质，以后根据细胞生长情况，每3天换液一次；

17、优选的，脐带间充质干细胞的体外扩增

18、(1)上述培养方法获得的细胞长到80％融合时，用0.25％胰蛋白酶和0.02％edta混合液消化，显微镜下观察，控制消化时间，待胞质回缩，加含10％fbs的dmem/f12培养液终止消化；

19、(2)将细胞悬液1000rpm离心3min，原代细胞以1：1的比例进行传代，记为p1代；

20、(3)传代第二天培养液换为mesenprorsa-mmedium培养液；p2代以后按1：3或l：4的比例传代；直至细胞彼此融合，铺满瓶底再重复上述操作。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明能具备极强的激素调节功效，可用以医治红斑狼疮和硬皮病等本身免疫系统疾病，减少体细胞或肝脏移植后的免疫排斥反映，提升体细胞或肝脏移植的通过率；能推动造血功能修复作用，与单一造血干细胞移殖较为，间充质干细胞美容和造血干细胞共移殖能明显提升败血症和不易治贫血等疾病的治疗实际效果。