检测MRSA的多重PCR引物、试剂盒、检测方法及应用与流程

本发明涉及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测，具体而言，涉及检测mrsa的多重pcr引物、试剂盒、检测方法及应用。

背景技术：

1、目前，检测粪便样品中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)检测方法包括高通量测序法、mrsa显色平板法和核酸组合物检测法。其中，高通量测序法存在价格昂贵、检测耗时长的劣势；而mrsa显色平板法(如法国科马嘉)更适用于非活菌或非葡萄球菌属活菌产品的检测，不适用于粪便样品，主要是由于粪便样品中存在其他耐甲氧西林的葡萄球菌(如缓慢葡萄球菌、表皮葡萄球菌、木葡萄球菌、耳葡萄球菌等非金黄色葡萄球菌属)的干扰，导致检测特异性差，灵敏度低。而核酸组合物检测法虽然能一定程度上实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测，但仍存在检测灵敏度低，检测样本局限于菌液无法满足粪便样本的检测需求的问题。

2、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供检测mrsa的多重pcr引物、试剂盒、检测方法及应用以解决上述技术问题。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明提供了用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球的多重pcr引物，其包括：第一引物组和第二引物组，第一引物组的核苷酸序列与seq id no.1-2所示的核苷酸序列至少具有95％的序列同一性，第二引物组的核苷酸序列与seq id no.3-4所示的核苷酸序列至少具有95％的序列同一性。

4、第一引物组是根据耐甲氧西林金黄色葡萄球(mrsa)的meca基因设计的扩增引物，第二引物组是根据耐甲氧西林金黄色葡萄球(mrsa)的sa442基因设计的扩增引物。本发明开发的多重pcr引物适用于包括不限于粪便样本中mrsa的检测，尤其是对于粪便样本的检测灵敏度与单一mrsa菌的检测灵敏度基本一致，即本发明提供的多重pcr引物和相应的检测方法对粪便样品的检测具有专属性(即特异性)强、灵敏度高(即检测限低)的技术优势。本发明提供的多重pcr引物的检测限可以达到0.3440cfu/g。

5、第一引物组的核苷酸序列与seq id no.1-2所示的核苷酸序列至少具有95％、或具有96％、或97％、或98％、或99％、或99.5％或100％的序列同一性，第二引物组的核苷酸序列与seq id no.3-4所示的核苷酸序列至少具有95％、或具有96％、或97％、或98％、或99％、或99.5％或100％的序列同一性。

6、在一种可选的实施方式中，第一引物组的核苷酸序列如下：

7、上游引物(seq id no.1)：suzhou precisiongene biotechnology co.,ltd

8、ccaatacaggaacagcatatgagat。

9、下游引物(seq id no.2)：

10、tgtttgagggtggatagcagtac。

11、第二引物组的核苷酸序列如下：

12、上游引物(seq id no.3)：

13、gtcgggtacacgatattcttcacg。

14、下游引物(seq id no.4)：

15、ctcgtatgaccagcttcggt。

16、采用上述100％序列同一性的第一引物组扩增目标样本后的扩增产物长度为534bp。采用上述100％序列同一性的第二引物组扩增目标样本后的扩增产物长度为178bp。

17、第二方面，本发明提供了一种组合物或试剂盒，其包括用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球的多重pcr引物。

18、在本发明应用较佳的实施方式中，组合物或组合物盒还包括：pcr反应预混液；

19、在一种可选的实施方式中，pcr反应预混液中包括dna聚合酶、dntp和染料。

20、dna聚合酶为属于家族a的dna聚合酶。

21、在一种可选的实施方式中，dna聚合酶为tth dna聚合酶或其突变体、taq dna聚合酶或其突变体、hawk z05聚合酶(如hawk z05fast polymerase)或其突变体、kapa高保真聚合酶、q5 dna聚合酶、kod dna聚合酶和pfu dna聚合酶中的至少一种。

22、dna聚合酶包括不限于用于rt-pcr的逆转录酶(rt酶)、用于pcr的dna聚合酶等。

23、在一种可选的实施方式中，上述组合物或组合物盒还包括阴性对照和阳性对照。

24、阴性对照为金黄色葡萄球菌atcc25923的dna，阳性对照为金黄色葡萄球菌atcc43300的dna。在其他实施方式中，阴性对照也可选自其他的金黄色葡萄球菌，阳性对照也可选自其他的金黄色葡萄球菌。

25、第三方面，本发明提供了用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球的多重pcr引物在制备耐甲氧西林金黄色葡萄球检测组合物或组合物盒中的应用。

26、在本发明应用较佳的实施方式中，组合物或组合物盒的检测用途通过如下检测方法进行检测：

27、配制pcr反应体系，并按照如下反应程序进行反应：95℃，3-10min；95℃30s，60℃30s，72℃90s，35个循环；70-72℃，1-10min；然后对pcr产物进行检测。

28、在上述反应程序下，可以实现meca基因和sa442基因的快速、准确检出。此外，本领域的技术人员可以根据所采用的模板来源类型和dna聚合酶的类型，调整预变性、变性、退火温度和延伸温度和时间。

29、在本发明应用较佳的实施方式中，pcr反应体系中第一引物组的上游引物和下游引物的终浓度为0.2-0.5μm，第二引物组的上游引物和下游引物的终浓度为0.2-0.5μm。在上述引物浓度配合比例下，能够实现meca基因和sa442基因的快速准确检出。

30、在本发明应用较佳的实施方式中，pcr反应体系中的模板dna来源为粪便、尿液或环境样本。

31、在本发明应用较佳的实施方式中，环境样本为医院环境样本或养老院环境样本。医院环境样本包括不限于设备、病床、凳子、病服等表面以及消毒间、手术间、隔离间、走廊环境样本、土壤样本等。

32、上述试剂盒包括不限于扩增试剂盒、杂交试剂盒等，本领域的技术人员容易想到将上述引物组与待测样本进行杂交反应。

33、第四方面，本发明还提供了一种检测耐甲氧西林金黄色葡萄球的方法，方法不以疾病的诊断为目的，方法包括：以用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球的多重pcr引物或组合物或试剂盒对待测核酸样本或菌液进行扩增反应，检测扩增产物中的meca和sa442基因存在与否。

34、在本发明应用较佳的实施方式中，配制pcr反应体系，并按照如下反应程序进行扩增反应：95℃，3-10min；95℃30s，60℃30s，72℃90s，35个循环；70-72℃，1-10min。

35、本发明具有以下有益效果：

36、本发明开发的多重pcr引物适用于包括不限于粪便样本中mrsa的检测，尤其是对于粪便样本的检测灵敏度与单一mrsa菌的检测灵敏度基本一致，即本发明提供的多重pcr引物和相应的检测方法对粪便样品的检测具有专属性(即特异性)强、灵敏度高(即检测限低)的技术优势。本发明提供的多重pcr引物的检测限可以达到0.3440cfu/g。

37、基于此，可以开发相应的组合物或试剂盒，从而满足mrsa的快速特异性检出需求。