一种重组病毒载体、包含其的免疫组合物以及用途的制作方法

本发明属于分子生物学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种包含编码cd4辅助性t细胞表位融合肽的多核苷酸的重组病毒载体、包含其的免疫组合物以及用途。

背景技术：

1、t辅助细胞(th细胞)是一种在免疫系统中起重要作用的t细胞，特别是在适应性免疫系统中。它们通过释放t细胞细胞因子来帮助其他免疫细胞的活性。这些细胞有助于抑制或调节免疫反应。它们在b细胞抗体类别的转换、细胞毒性t细胞的活化和生长以及吞噬细胞如巨噬细胞的杀菌活性最大化中是必需的。

2、成熟th细胞表达蛋白cd4，称为cd4+t细胞。通常将这样的cd4+t细胞作为免疫系统内的辅助t细胞进行预定义的处理。例如，当抗原呈递细胞在ii类mhc上表达抗原时，cd4+细胞将通过细胞与细胞相互作用的组合(例如cd40(蛋白质)和cd40l)和细胞因子来帮助这些细胞。

3、可以从hiv(一种主要感染cd4+t细胞的病毒)中看到辅助t细胞的重要性。在艾滋病毒感染的晚期阶段，功能性cd4+t细胞的丧失导致被称为获得性免疫缺陷综合征(aids)的感染症状阶段。当血液或其他体液早期发现hiv病毒时，连续治疗可能会延迟发生这种情况的时间。如果发生艾滋病，治疗也可以更好地管理艾滋病的过程。还有其他罕见的疾病，如淋巴细胞减少症，导致cd4+t细胞的缺失或功能障碍。这些疾病产生类似的症状，其中许多是致命的。

4、抗原表位(antigenic epitope)，简称“表位”(epitope)，也称为“抗原决定簇”(antigenic determinant)，是指抗原表面上决定抗原特异性的化学基团。抗原表位可被免疫系统(尤其是抗体、b细胞或者t细胞)所识别。抗体中能识别抗原表位的区域叫做“互补位”或“抗体决定簇”。尽管通常抗原表位是指外来蛋白质等物质的其中一部分，但只要能被自身免疫系统所识别的表位，也被归为抗原表位。

5、蛋白质抗原的表位根据它们的结构以及与互补位的交互作用，被分为构象表位和线性表位这两种类型。其中构象表位由抗原氨基酸序列中的不连续部分组成，因此互补位和抗原表位的交互作用是基于表面的三维特征和形状，或者是抗原的三级结构。大部分的抗原表位都属于构象表位。与此相反，线性表位是由一段连续的抗原氨基酸序列构成，与抗原的交互作用的基础是其一级结构。

6、t细胞表位(t cell epitope)主要是由8-17氨基酸组成的短肽构成，出现在抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,apc)上，这种抗原表位将会和主要组织相容性复合体(mhc)相结合形成复合体，并与相应的t细胞表位受体结合，从而活化t细胞，产生相应细胞免疫应答(shimonkevitz et al.,1984；babbitt et al.,1985；buus et al.,1986；townsend and bodmer,1989)。与表位结合的mhc主要有两类分子，其中，i类主要组织相容性复合体所呈现的t细胞抗原表位通常是由8至11个氨基酸长度的多肽，而ii类主要组织相容性复合体所呈现的t细胞抗原表位相对更长，由13-17个氨基酸组成。

7、辅助t细胞表位(th epitope，即th表位)是指t细胞表位中的，与mhc分子结合形成的复合体能被cd4辅助性t细胞受体识别的一类t细胞表位。th表位主要与存在于由主要组织相容性复合体(mhc)的ii类基因编码的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,apc)表面上的分子结合。然后，ii类分子和肽表位的复合物被t辅助淋巴细胞表面上的特异性t细胞受体(tcr)识别。以这种方式，在mhc分子的环境中呈现抗原表位的t细胞可以被激活，并为b淋巴细胞分化提供必要的信号。传统上，肽免疫原的辅助t细胞表位的来源是肽共价偶联的载体蛋白，但是该偶联过程可引入其他问题，例如在偶联过程中抗原决定簇的修饰和以针对肽的抗体为代价的针对载体的抗体的诱导(schutze,m.p.,leclerc,c.jolivet,m.audibert,f.chedid,l.carrier-induced epitopic suppression,a major issue forfuture synthetic vaccines.j immunol.1985,135,2319-2322；dijohn,d.,torrese,j.r.murillo,j.herrington,d.a.et al.effect of priming with carrier on responseto conjugate vaccine.the lancet.1989,2,1415-1416)。此外，在制备中使用无关蛋白引入质量控制问题。合适的载体蛋白的选择在设计肽疫苗时非常重要，其选择受到其大规模生产的毒性和可行性等因素的限制。这种方法还有其他限制，包括可偶联的肽负载的大小和可以安全施用的载体的剂量(audibert,f.a.c.,l.1984.modern approaches tovaccines.molecular and chemical basis of virus virulence and immunogenicity.,cold spring harbor laboratory,new york.)。虽然载体分子允许诱导强的免疫应答，但它们也与不利影响相关，例如抑制抗肽抗体应答(herzenberg,l.a.and tokuhisa,t.1980.carrier-priming leads to hapten-specific suppression.nature 285:664；schutze,m.p.,leclerc,c.,jolivet,m.,audibert,f.,and chedid,l.1985.carrier-induced epitopic suppression,a major issue for future synthetic vaccines.jimmunol 135:2319；etlinger,h.m.,felix,a.m.,gillessen,d.,heimer,e.p.,just,m.,pink,j.r.,sinigaglia,f.,sturchler,d.,takacs,b.,trzeciak,a.,and et al.,1988.assessment in humans of a synthetic peptide-based vaccine against thesporozoite stage of the human malaria parasite,plasmodium falciparum.jimmunol 140:626)。

8、一般来说，免疫原必须包含辅助t细胞表位，除了将被表面ig识别的表位或存在于细胞毒性t细胞上的受体之外。应该意识到，这些类型的表位可能是非常不同的。对于b细胞表位，构象是重要的，因为b细胞受体直接与天然免疫原结合。相比之下，由t细胞识别的表位不依赖于表位的构象完整性，并且由针对ctl的约9个氨基酸的短序列和针对辅助t细胞的稍长的序列(长度限制较小)组成。这些表位的唯一要求是它们可以分别容纳在i类或ii类分子的结合裂口中，并且然后复合物能够与t细胞受体结合。ii类分子的结合位点在两端是开放的，允许与报道的短至8个氨基酸残基(fahrer,a.m.,geysen,h.m.,white,d.o.,jackson,d.c.and brown,l.e.analysis of the requirements for class ii-restricted t-cell recognition of a single determinant revealsconsiderablediversity in the t-cell response and degeneracy of peptidebinding to hed j.immunol.1995.155:2849-2857)的表位结合的肽的长度变化更大(brown,j.h.,t.s.jardetzky,j.c.gorga,l.j.stern,r.g.urban,j.l.strominger andd.c.wiley.1993.three-dimensional structure of the human class iihistocompatibility antigen hla-dr1.nature 364:33)。

9、th表位能刺激并活化辅助t细胞，相应地，促进cd8 t细胞和b细胞活化，最终提高免疫应答。实质上，th表位除了能活化针对自身的免疫应答外，还能有效帮助与之关联的其他抗原或表位的免疫应答。因此，可以将异源性的强th表位与目的免疫原融合，据此可以提高目的免疫原的免疫原性。一种称之为“padre(pan hla dr-binding epitope)”的人造强th表位已用于多个疫苗的融合构造，以提高相关免疫原的免疫应答水平(del guercio etal.,vaccine,1997,15:441.；franke,e.d.et al.,vaccine,1999,17:1201；jeffalexander et al.,j immunol,2000,164(3)1625-1633；jeff alexander et al.,vaccine,2004,22:2362.；la rosa,corinna et al.,the journal of infectiousdiseases,2012,205:1294-304)。此外，源于破伤风毒素(tetanus toxin)的强th表位p2也常用于与目的免疫原偶联，以提高免疫原性(panina-bordignon p et al.,eur jimmunol,1989,19:2237-42；la rosa,corinna et al.,the journal of infectiousdiseases,2012,205:1294-304)。

10、但一般而言，用于提高免疫原性的th表位通常为异源性的，换言之，疫苗受试者体内不会存在针对该th表位自身的高水平的免疫应答。因此，使用上述的强th表位接种疫苗受试者时，很可能的情况是疫苗受试者的免疫系统是初次接触此类th表位，受体免疫系统活化针对此类th表位和目的免疫原的表位基本上是同步的，针对此类th表位的t细胞的生成时间和数量与目的免疫原相似，这样的话，对于帮助目的免疫原的效果会因此受限。特别是对于弱免疫原性的肿瘤抗原，此类th表位的辅助作用更难发挥。事实上，直接采用强th表位虽然能活化肿瘤抗原，但其激发的细胞免疫应答水平仍较低，不能满足肿瘤疫苗的需要(ghaffari-nazari h etal.,plos one,2015,10(11):e0142563)。

11、因此，需要新的th表位策略来提高目的免疫原免疫原性，特别是一些弱的免疫原，例如肿瘤抗原。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种cd4辅助性t细胞表位融合肽，通过该表位融合肽，目的免疫原的免疫原性得以提高。

2、进一步地，本发明利用来源于巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)和流感病毒(influvirus,flu)的强th表位获得表位融合肽来提高目的免疫原的免疫原性。

3、为了本发明的目的以下定义下列术语。

4、“表位融合肽”是指将若干表位连接在一起所形成的一个肽。

5、“目的免疫原”是指为实现某种免疫应答，所采用的免疫原，包括抗原等具有免疫学活性的物质，优选为蛋白。

6、本发明的另一目的是提供一种所述表位融合肽和所述目的免疫原的融合蛋白。

7、为实现上述目的，本发明提供一种cd4辅助性t细胞表位融合肽，其包含巨细胞病毒表位和/或流感病毒表位。本发明还提供一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包含编码cd4辅助性t细胞表位融合肽的多核苷酸，所述cd4辅助性t细胞表位融合肽包含巨细胞病毒表位和/或流感病毒表位。

8、在本发明的一个实施方案中，所述表位融合肽包含选自seq id no:1-10所示的巨细胞病毒表位中的一种或多种，和/或选自seq id no:11-23所示的流感病毒表位中的一种或多种。

9、在本发明的一个实施方案中，所述表位融合肽由选自seq id no：1-10所示的巨细胞病毒表位中的一种或多种，和/或选自seq id no：11-23所示的流感病毒表位中的一种或多种组成。优选地，所述表位融合肽由5个或10个巨细胞病毒表位和/或由8个或13个流感病毒表位组成，例如seq id no:34或44所示的表位融合肽。最优选地，所述表位融合肽由13个流感病毒表位组成，例如seq id no:48或60所示的表位融合肽。

10、优选地，所述表位融合肽诱导体液或细胞免疫应答。

11、优选地，重组病毒是痘苗病毒，优选为复制型痘苗病毒载体，例如痘苗病毒天坛株，例如752-1株，或者为非复制型痘苗病毒载体，例如痘苗病毒减毒疫苗安卡拉株(modified vaccinia ankara，mva)。

12、本发明还提供了所述表位融合肽和目的免疫原的融合蛋白。

13、本发明还提供了编码所述表位融合肽和/或所述融合蛋白的多核苷酸。

14、在本发明的一个实施方案中，所述目的免疫原为任意一种或多种免疫原。优选的，所述目的免疫原为肽、抗原、半抗原、碳水化合物、蛋白质、核酸、过敏原、病毒或病毒的一部分、细菌、寄生虫或其它完整的微生物。

15、在本发明的一个实施方案中，所述抗原为肿瘤抗原或感染相关抗原。

16、在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤抗原选自肺癌抗原、睾丸癌抗原或黑色素瘤抗原、肝癌抗原、乳腺癌抗原或前列腺癌抗原中的一种或多种。

17、在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤抗原选自lage抗原、mage抗原或ny-eso-1抗原中的一种或多种。优选地，lage抗原为lage-1，mage抗原为mage-a3。进一步优选地，所述肿瘤抗原包含lage-1、mage-a3和ny-eso-1。优选地，所述lage-1的氨基酸序列如seq idno:24所示，所述mage-a3的氨基酸序列如seq id no:25所示，所述ny-eso-1的氨基酸序列如seq id no:26所示；还进一步优选地，所述肿瘤抗原包含lage-1、mage-a3和ny-eso-1。

18、在本发明的一个实施方案中，所述感染相关抗原选自hiv抗原、流感病毒抗原或hbv抗原中的一种或多种。

19、优选地，所述融合蛋白如seq id no:55-58、62中之一所示。

20、优选地，所述融合蛋白的编码基因如seq id no:63所示。

21、本发明的另一目的是提供一种免疫组合物，所述免疫组合物包含治疗有效量的根据本发明的表位融合肽、融合蛋白、多核苷酸和/或重组病毒载体，以及药学上可接受的载体。优选地，该免疫组合物为疫苗。

22、本发明的另一目的是提供一种药盒，所述药盒包含根据本发明的表位融合肽、融合蛋白、多核苷酸、重组病毒载体和/或免疫组合物，以及其使用说明。

23、本发明还提供了根据本发明的表位融合肽、融合蛋白、多核苷酸、重组病毒载体和/或免疫组合物在制备提高目的免疫原的免疫原性的药物或疫苗中用途。

24、本发明还提供了一种使用根据本发明的表位融合肽提高目的免疫原的免疫原性的方法，包括将疫苗受试者或人群中已有较强免疫应答的cd4辅助性t细胞表位与目的免疫原融合形成的融合蛋白。其方法具体为：

25、(1)选择一个或多个cd4辅助性t细胞的表位，所述表位与mhc分子结合形成的复合体能被cd4辅助性t细胞受体识别，并且在疫苗接种前，疫苗受试者体内已经存在针对所述表位中至少一个表位产生了t细胞免疫应答；

26、(2)将上述表位融合以制成表位融合肽，将所述表位融合肽与目的免疫原融合以制成融合蛋白，表达融合蛋白并制成疫苗，其表达载体形式可以是dna疫苗载体形式，可以是蛋白疫苗载体形式，还可以是病毒疫苗载体形式；

27、(3)将上述疫苗接种给疫苗受试者，接种时可以选择适当的佐剂，例如不完全弗氏佐剂，完全弗氏佐剂，氢氧化铝佐剂等。

28、进一步地，所述使用方法的步骤(1)还包括检查疫苗受试者mhc表型的步骤。优选地，检查疫苗受试者mhc表型包括检查疫苗受试者的mhc ii类基因亚型型别。

29、本发明还提供了一种治疗或预防有需要的受试者的病症的方法，其包括给予治疗有效量的本发明的表位融合肽、免疫组合物、多核苷酸和/或重组病毒载体。优选地，所述病症选自恶性肿瘤、细菌和病毒性感染中的一种或多种。优选地，所述恶性肿瘤为乳腺癌或结肠癌。优选地，所述感染是慢性感染。优选地，该方法中，初免使用dna疫苗载体，加强免疫使用蛋白疫苗载体，更优选地，初免使用pvkd1.0-ci-lmnb dna疫苗，加强免疫使用lmnb-i13蛋白。

30、本发明提供的表位融合肽能大幅度提高目的免疫原，尤其是弱免疫原的细胞免疫应答水平，是克服免疫系统对抗原免疫耐受性，尤其是对肿瘤抗原或感染相关抗原免疫耐受性的有效手段，适用于高效增强疫苗的效力。