专利名称:生产促胰岛素分泌肽glp－1(7－36)的基因工程菌以及生产glp－1(7－36)的方法
技术领域：
本发明涉及生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)(Glucagon LikePeptide，胰高血糖素类多肽)的基因工程菌和利用该基因工程菌发酵生产GLP-1(7-36)的方法。GLP-1(7-36)是可能作为II型糖尿病治疗药物的一种活性多肽。
背景技术：
GLP-1是人体分泌的一种肠道激素，由胰高血糖素原(Proglucagon)分子经肠道蛋白水解酶作用而产生，因而称为胰高血糖素类多肽。当血糖浓度高于6mmol/L时，GLP-1能显著促进胰岛素分泌；而一旦血糖浓度恢复至正常值则不再继续作用，这一点对II型糖尿病的治疗十分有用(中国专利公开号CN 1129224A)。
人体内的GLP-1有二种形式，一种为GLP-1(7-36)NH2，是由30个氨基酸残基组成的多肽，其C端是酰胺化了的；另一种为GLP-1(7-37)，是由31个氨基酸残基组成的多肽。GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)有相同的促胰岛素分泌作用，例如实验证明，在1×10-10～1×10-11mol/L浓度下，GLP-1对离体胰岛细胞作用时，促进了胰岛素的分泌，故又称它们为促胰岛素分泌肽。
中国专利公开CN 1129224A说明书第32页报道，与上述二种促胰岛素分泌肽一样，GLP-1(7-36)也具有促胰岛素分泌作用。
已经有报道通过基因工程方法来生产GLP-1(7-36)NH2，但还没有研究者尝试用基因工程技术生产GLP-1(7-36)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是构建用于生产GLP-1(7-36)的一系列基因工程菌株，以及利用这些菌株生产GLP-1(7-36)的方法。应用本发明提供的基因工程菌以及相应的方法，能够大规模低成本地生产GLP-1(7-36)。
GLP-1(7-36)的氨基酸序列如下His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg式中英文缩写表示His组氨酸，Ala丙氨酸，Glu谷氨酸，Gly甘氨酸，Thr苏氨酸，Phe苯丙氨酸，Ser丝氨酸，Asp天冬氨酸，Val缬氨酸，Tyr酪氨酸，Leu亮氨酸，Gln谷氨酰胺，Lys赖氨酸，Trp色氨酸，Ile异亮氨酸，Arg精氨酸本发明是通过以下技术方案来实现的。
本发明提供的生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，该菌属大肠杆菌(Escherichia coli)，保藏在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2001年7月11日，保藏号为CGMCC No.0599。该基因工程菌携带的质粒中包含有表达GLP-1(7-36)的基因，宿主细胞为大肠杆菌。
本发明提供的生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，其携带的质粒中包含有n个表达GLP-1(7-36)的基因，其中，n为从1到32的整数。
本发明提供的生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，优选例为其携带的质粒中包含有16个表达GLP-1(7-36)的基因。
本发明提供的生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，其宿主细胞大肠杆菌为JM103，JM109或DH5α。
本发明提供的生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，携带的质粒的启动子为Lac，PL，Tac，PT7或Trp。
本发明的基因工程菌的构建方法，包括将n个表达GLP-1(7-36)的基因克隆于质粒中，并将质粒转化到宿主细胞大肠杆菌中，其中，n为从1到32的整数。
本发明的基因工程菌的构建方法中，所述的宿主细胞大肠杆菌为JM103，JM109或DH5α。
本发明的基因工程菌的构建方法中，所述的质粒的启动子为Lac，PL，Tac，PT7或Trp。
本发明的生产GLP-1(7-36)的方法，包括构建权利要求
1或2或3或4或5定义的基因工程菌，然后在液体培养基中进行发酵培养，产生和积累含有GLP-1(7-36)的包涵体，通过细胞破碎和包涵体的分离纯化得到融合蛋白，再经过融合蛋白裂解以及GLP-1(7-36)的纯化得到产品。
本发明采用如下方法构建基因工程菌株将1个表达GLP-1(7-36)的基因，或者将2到32个表达GLP-1(7-36)的基因串联成聚合体后，克隆于大肠杆菌质粒中，启动子可使用Lac，PLTac，PT7或者Trp等，GLP-1(7-36)是作为该基因工程菌所表达的融合蛋白的一个主要组成部分通过后加工来得到的。
基因工程菌的构建对本发明至关重要。根据遗传密码的简并性，大多数氨基酸可以具有几组不同的密码子。本发明的各种实施方案包括使用各种不同的密码子来构成表达GLP-1(7-36)的基因。
用本发明提供的基因工程菌，结合微生物发酵和下游分离纯化技术，可以大规模地生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)，生产成本大大低于化学合成法生产GLP-1(7-36)，与现有技术生产GLP-1(7-36)NH2或GLP-1(7-37)相比也要低得多。GLP-1(7-36)有可能成为II型糖尿病治疗药物，通过实施本发明，可以为II型糖尿病患者大量提供价格低廉的活性多肽GLP-1(7-36)。
现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步说明。
图1为本发明生产GLP-1(7-36)的工艺流程图。
图2为实施例所得产品GLP-1(7-36)的HPLC图谱。
图3为实施例所得产品GLP-1(7-36)的毛细管电泳图谱。
图4为实施例所得产品GLP-1(7-36)的氨基酸组成分析结果。
图5为实施例所得产品GLP-1(7-36)氨基酸序列分析结果。
图6为实施例所得产品GLP-1(7-36)质谱分析结果。
图7为实施例所得产品GLP-1(7-36)的生物活性试验结果。实验条件NOD小鼠体重20克，腹腔注射200微升40％葡萄糖，每个数据点样本数目均为6。
具体实施方式
实施例1构建含有1个GLP-1(7-36)基因的菌株，并利用该菌株生产GLP-1(7-36)按GLP-1(7-36)的氨基酸序列，合成如下4个基因片段(1)AAT TCC AGA TCT CGT CAC GCG GAA GGT ACC TTCACC AGC GAT GTG AGC AGC TAT CTG(2)ACC TTC CAG ATA GCT GCT CAC ATC GCT GGT GAAGGT ACC TTC CGC GTG ACG AGA TCT GG(3)GAA GGT CAG GCG GCG AAA GAA TTT ATC GCG TGGCTG GTG AAA GGT CGT GGA TCC TAG A(4)AG CTT CTA GGA TCC ACG ACC TTT CAC CAG CCA CGCGAT AAA TTC TTTCGC CGC CTG
然后将4个基因片段连接成一个表达GLP-1(7-36)的基因，基因片段的连接步骤为将上述四个基因片段含量各为A260nm＝5，分别溶于50微升重蒸水中，No.1和No.2各取1微升置于1.5毫升离心管中，No.3和No.4各取1微升放于另一个离心管中。两管中各加1微升polynucleotide kinase buffer 1×10(聚核苷酸激酶缓冲液)，1微升的1mM ATP-钠盐以及1微升polynucleotide kinase(聚核苷酸激酶)，37℃保温1小时，水浴加热至90℃，维持5分钟，然后使之徐徐冷却至室温，将两个试管中的内容物混合后加1mM ATP-钠盐1微升，T4-DNA ligase buffer 1×10(T4-DNA连接酶缓冲液)，1微升，T4-DNA ligase(T4-DNA连接酶缓冲液)1微升，混合物于16℃放置过夜，1％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭显色证明连接完成。
取大肠杆菌质粒，启动子为Lac，经过EcoR I和Hind III双酶解后，加苯酚-氯仿抽提，取水层，再用氯仿洗涤水层2次，加异丙醇60％沉淀，室温1小时，离心，将沉淀中的有机溶剂蒸发除去后，将上述的连接完成的基因与经过双酶切的质粒溶液混合，加1mMATP-钠盐1微升T4DNA ligase buffer 1×10 1微升T4ligase，加T4DNA-ligase 1微升，18℃过夜。
大肠杆菌受体菌JM103(或JM109，DH5α)于50毫升LB培养液，37℃振荡培养至A600nm达0.6时，离心，收集菌体，悬浮于冰冷的10毫升CaCl2溶液中(CaCl2，60mM，甘油15％，10mM PIPES
哌嗪-N，N’-双[2-乙烷磺酸]
，pH 7.0，经过灭菌)，再用3000rpm离心，悬浮于2毫升冰冷的上述CaCl2溶液中，冰浴中保存备用。
取受体细胞50微升，将克隆的质粒取5微升，混合后42℃维持2分钟，冷却，加LB培养液100微升，37℃，保温1小时，分别涂琼脂糖板(含50微克/毫升氨苄青霉素Ap)，37℃培养过夜，挑取菌落。进一步培养，抽提质粒，用EcoR I/Hind III双酶切后，用1％琼脂糖凝胶电泳检查克隆的基因。DNA序列分析单个GLP-1(7-36)基因的DNA序列分析与设计符合His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp ValCAC GCG GAA GGT ACC TTC ACC AGC GAT GTGGTG CGC CTT CCA TGG AAG TGG TCG CTA CACSer Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala LysAGC AGC TAT CTG GAA GGT CAG GCG GCG AAATCG TCG ATA GAC CTT CCA GTC CGC CGC TTTGlu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly ArgGAA TTT ATC GCG TGG CTG GTG AAA GGT CGTCTT AAA TAG CGC ACC GAC CAC TTT CCA GCA用构建好的基因工程菌株，经过发酵、菌体收集、细胞破碎、包涵体分离纯化、融合蛋白裂解以及GLP-1(7-36)纯化等步骤，即可得到纯度达99％的产品。图2和图3分别为所得GLP-1(7-36)的HPLC和毛细管电泳图谱。
所得产品经氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、质谱分析等测试，证实应用本发明提供的基因工程菌，经发酵及下游加工后所得多肽为GLP-1(7-36)。
图4为氨基酸组成分析结果，所得多肽的氨基酸组成与GLP-1(7-36)完全相同。
图5为所得多肽的氨基酸序列分析结果，其N末端15个氨基酸的组成和排列与GLP-1(7-36)完全相同。
图6为质谱分析结果，测定所得多肽分子量为3297.12，在误差范围内与GLP-1(7-36)的分子量3298.68相符合。
考察所得GLP-1(7-36)的生物活性，发现其与GLP-1(7-37)及GLP-1(7-36)NH2相同，均有促进胰岛素分泌和降低血糖浓度的作用。图7为NOD小鼠耐糖实验结果。对体重20克的NOD小鼠分别给葡萄糖，葡萄糖+10微克GLP-1(7-36)、葡萄糖+10微克GLP-1(7-36)NH2、葡萄糖+10微克GLP-1(7-37)，发现只给葡萄糖的小鼠血糖浓度出现很高的峰值，而给药的小鼠血糖浓度均基本保持稳定，不出现血糖高峰。这是由于GLP-1促进了胰岛素分泌，从而有效地控制了血糖浓度。实验结果表明，GLP-1(7-36)、GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)具有相同的促胰岛素分泌作用。实施例2构建含有16个GLP-1(7-36)基因的菌株，并利用该菌株生产GLP-1(7-36)将实施例1所得质粒溶液取5微升，置于0.5毫升塑料试管中加Bgl II内切酶buffer1×10 1微升，Bgl II和Hind III 1微升，37℃，保温1小时，然后取样走1％琼脂糖凝胶电泳分离GLP-1(7-36)基因片段，回收后备用。
另取实施例1所得质粒溶液1微升，加BamH I buffer 1×10 1微升，然后加BamH I和Hind III各1微升，37℃保温1小时，苯酚-氯仿处理，离心分取水层，用氯仿洗涤2次，离心分取水层，加60％异丙醇溶液沉淀，离心，蒸发，除去沉淀中的有机溶剂，加10微升水溶解，与Bgl II和Hind III双酶解的GLP-1基因片段混合，加T4DNA-ligase buffer 1×10 1微升，1mM ATP钠盐1微升及T4DNA-ligase2微升，18℃保温过夜，完成连接。
转化JM103，受体菌与上述相同方法制备。涂板在50μg/ml Ap条件下，37℃培养过夜，挑选菌落进行培养。抽取质粒，经EcoR I/HindIII双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳检查筛选含有由两个GLP-1(7-36)基因组成的二聚体的质粒。
如上重复进行GLP-1(7-36)基因串联，得到质粒中含有由16个GLP-1(7-36)基因组成的串联基因。按实施例1的方法将这一质粒转化到大肠杆菌受体菌JM103，即构建完成了有16个GLP-1(7-36)串联基因的基因工程菌。
用构建好的基因工程菌株进行发酵，再将菌体收集，经细胞破碎、包涵体分离纯化、融合蛋白裂解和GLP-1(7-36)的纯化等步骤，即得到纯度达99％的产品。
所得产品经氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、质谱分析等测试，证实本实施例所得多肽为GLP-1(7-36)。
按照与实施例1相同的方法进行活性测定，实验结果表明，本实施例所得GLP-1(7-36)产品生物活性同实施例1。实施例3构建含有32个GLP-1(7-36)基因的菌株，并利用该菌株生产GLP-1(7-36)实施例2中得到的质粒中包含有16个GLP-1(7-36)基因的串联基因，依前面所述方法，将2个这样的基因串联起来，即可得到包含32个GLP-1串联基因的质粒。再将该质粒转化到JM103受体菌，即得到n＝32的基因工程菌。
用构建好的基因工程菌株进行发酵，再将菌体收集，经细胞破碎、包涵体分离纯化、融合蛋白裂解和GLP-1(7-36)的纯化等步骤，即得到纯度达99％的产品。
所得产品经氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、质谱分析等测试，证实本实施例所得多肽为GLP-1(7-36)。
按照与实施例1相同的方法进行活性测定，实验结果表明，本实施例所得GLP-1(7-36)产品生物活性同实施例1。
权利要求
1.一种生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌，其特征在于该基因工程菌携带的质粒中包含有表达GLP-1(7-36)的基因，宿主细胞为大肠杆菌。
2.根据权利要求
1所述的基因工程菌，其特征在于所述质粒中包含有n个表达GLP-1(7-36)的基因，其中，n为从1到32的整数。
3.根据权利要求
2所述的基因工程菌，其特征在于所述质粒中包含有16个表达GLP-1(7-36)的基因。
4.根据权利要求
1或2或3所述的基因工程菌，其特征在于所述的大肠杆菌是JM103，JM109或DH5α。
5.根据权利要求
1或2或3所述的基因工程菌，其特征在于所述质粒的启动子为Lac，PL，Tac，PT7或Trp。
6.一种生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的基因工程菌的构建方法，包括将n个表达GLP-1(7-36)的基因克隆于质粒中，并将质粒转化到宿主细胞大肠杆菌中，其中，n为从1到32的整数。
7.根据权利要求
6所述的构建方法，其特征在于所述的宿主细胞大肠杆菌是JM103，JM109或DH5α。
8.根据权利要求
6所述的构建方法，其特征在于所述的质粒的启动子为Lac，PL，Tac，PT7或Trp。
9.一种生产促胰岛素分泌肽GLP-1(7-36)的方法，包括构建权利要求
1或2或3或4或5定义的基因工程菌，然后在液体培养基中进行发酵培养，产生和积累含有GLP-1(7-36)的包涵体，通过细胞破碎和包涵体的分离纯化得到融合蛋白，再经过融合蛋白裂解以及GLP-1(7-36)的纯化得到产品。
专利摘要
本发明涉及生产促胰岛素分泌肽GLP－1(7－36)的基因工程菌以及利用该基因工程菌生产GLP－1(7－36)的方法。基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌,携带的质粒中包含有n=1到32个表达GLP－1(7－36)的基因,其构建方法包括将n个(n=1到32)表达GLP－1(7－36)的基因克隆于大肠杆菌质粒中,并将质粒转化到大肠杆菌中。然后在液体培养基中发酵培养构建好的基因工程菌,以产生和积累含有GLP－1(7－36)的包涵体,并通过后续的融合蛋白裂解以及分离纯化工艺得到GLP－1(7－36)。使用本发明提供的基因工程菌及相应工艺生产促胰岛素分泌肽GLP－1(7－36),生产成本大大低于现有技术化学合成法。鉴于GLP－1(7－36)具有促胰岛素分泌作用,是一种可能用于治疗II型糖尿病的活性多肽,本发明使得大规模低成本地生产这种多肽成为可能。
文档编号C12N15/70GKCN1363654SQ01126278
公开日2002年8月14日 申请日期2001年7月19日
发明者孙玉昆, 伍登熙, 巫爱珍, 朱志勇, 余刚, 周加祥, 赵少陵 申请人:上海华谊生物技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan