专利名称:生产l－氨基酸的方法和新型基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及发酵生产L-氨基酸的方法，具体地说涉及生产L-赖氨酸和L-谷氨酸的方法，以及涉及用于所述方法的微生物和新型基因。L-赖氨酸广泛用作动物饲料添加剂等，而L-谷氨酸广泛用作调味品的原料等。
而且，已经公开了采用重组DNA技术增强L-氨基酸生物合成酶，从而提高L-氨基酸生产能力的各种技术。例如，对于具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌，已经知道可以通过导入不同所述基因提高所述细菌的生产能力，其中所述基因为编码其L-赖氨酸和L-苏氨酸反馈抑制作用已脱敏的天冬氨酸激酶基因(突变型lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氢吡啶二羧酸合酶基因(dapA)、二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)和二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(WO96/40934)、lysA和ddh(日本专利公开(kokai)号9-322774)、lysC、lysA和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因)(ppc)(日本专利公开号10-165180)、突变型转氨酶基因(aspC)(日本专利公开号10-215883)。
而且，对于埃希氏菌属(Escherichia)细菌，已经知道通过依次增强dapA、突变型lysC、dapB和二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(或四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶基因(dapD)和琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶基因(dapE))(WO 95/16042)，提高L-赖氨酸的生产能力。顺便提出在WO95/16042中，错误地将四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶描述为琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶。
还报道了导入大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的编码柠檬酸合酶的基因有效提高棒状杆菌属或短杆菌属细菌的L-谷氨酸生产能力(日本特许公报号7-121228)。另外，日本专利公开号61-268185公开了具有包含来自棒状杆菌的谷氨酸脱氢酶基因的重组DNA的细胞。日本专利公开号63-214189还公开了通过增强谷氨酸脱氢酶基因、异柠檬酸脱氢酶基因、乌头酸水合酶基因和柠檬酸合酶基因提高L-谷氨酸生产能力的技术。
然而，没有报道棒状杆菌编码果糖磷酸转移酶基因的结构，迄今为止也不了解利用编码果糖磷酸转移酶基因培育棒状杆菌。
另外，仍不了解棒状杆菌例如短杆菌属细菌的编码果糖磷酸转移酶的基因。
为了实现上述目的，本发明发明者进行了不懈研究。结果他们发现，如果将编码果糖磷酸转移酶的基因导入棒状杆菌中以增强果糖磷酸转移酶的活性，就能够提高L-赖氨酸或L-谷氨酸的产量。他们还成功地分离出编码乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)果糖磷酸转移酶的基因。因此他们完成了本发明。
也就是说，本发明提供(1)胞内果糖磷酸转移酶活性增强并且能够产生L-氨基酸的棒状杆菌。
(2)按照(1)的棒状杆菌，其中所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸。
(3)按照(1)的棒状杆菌，其中所述果糖磷酸转移酶活性是因为所述细菌细胞中编码果糖磷酸转移酶基因拷贝数增加而增强。
(4)按照(3)的棒状杆菌，其中所述编码果糖磷酸转移酶的基因得自埃希氏菌属细菌。
(5)按照(3)的棒状杆菌，其中所述编码果糖磷酸转移酶的基因得自棒状杆菌。
(6)一种生产L-氨基酸的方法，该方法包括以下步骤在培养基中培养按照(1)至(5)任一项的棒状杆菌，在培养液中产生并积累L-氨基酸，并从培养物中收集L-氨基酸。
(7)按照(6)的方法，其中所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸。
(8)按照(6)或(7)的方法，其中所述培养基包含作为碳源的果糖。
(9)编码下面(A)或(B)定义的蛋白质的DNA(A)具有序列表SEQ ID NO14氨基酸序列的蛋白质，(B)具有存在一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒置的序列表SEQ ID NO14氨基酸序列的蛋白质，而且该蛋白质具有果糖磷酸转移酶活性。
(10)按照(9)的DNA，所述DNA是下面(a)或(b)定义的DNA(a)包含序列表SEQ ID NO13核苷酸序列中核苷酸号为881-2499的核苷酸序列的DNA，(b)在严格条件下与序列表SEQ ID NO13核苷酸序列中核苷酸号为881-2499的核苷酸序列或者由所述核苷酸序列制备的探针杂交并编码具有果糖磷酸转移酶活性的蛋白质的DNA。
下面将详细解释本发明。(1)本发明的棒状杆菌本发明的棒状杆菌是具有L-氨基酸生产能力和胞内果糖磷酸转移酶活性增强的棒状杆菌。所述L-氨基酸可以是L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-丝氨酸等。其中优选L-赖氨酸和L-谷氨酸。尽管下面主要用具有L-赖氨酸生产能力或L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌解释本发明的实施方案，但是本发明可同样用于任何L-氨基酸，只要需要L-氨基酸的合适生物合成系统位于果糖磷酸转移酶的下游。
本发明所指的棒状杆菌包括Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology(第8版，第599页(1974))中定义的一组微生物，它们是不能产生孢子的需氧、革兰氏阳性非抗酸杆菌。包括迄今分类为短杆菌属、但是目前归入棒状杆菌属(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))的细菌，还包括属于与棒状杆菌属紧密相关的短杆菌属或微杆菌属细菌。适合用于生产L-赖氨酸或L-谷氨酸的棒状杆菌菌株实例包括例如以下菌株嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC 13870(Corynebacteriumacetoacidophilum ATCC 13870)；醋谷棒状杆菌ATCC 15806(Corynebacterium acetoglutamicumATCC 15806)；美棒状杆菌ATCC 15991(Corynebacterium callunae ATCC15991)；谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032(Corynebacterium glutamicumATCC 13032)；(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 14020(Brevibacterium divaricatumATCC 14020)；(乳发酵短杆菌)ATCC 13869(Brevibacterium lactofermentumATCC 13869)；(百合花棒状杆菌)ATCC 15990(Corynebacterium lilium ATCC15990)；(黄色短杆菌)ATCC 14067(Brevibacterium flavum ATCC14067)；Corynebacterium melassecola ATCC 17965；解糖短杆菌ATCC 14066(Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066)；Brevibacterium immariophilum ATCC 14068；玫瑰色短杆菌ATCC 13825(Brevibacterium roseum ATCC13825)；生硫短杆菌ATCC 19240(Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240)；嗜氨微杆菌ATCC 15354(Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354)；Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)。
为了获得这些菌株，例如可以由美国典型培养物保藏中心(地址12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，美国)提供。就是说，每种菌株都有登记号，人们可以利用登记号要求供给每种菌株。对应于所述菌株的登记号显示在美国典型培养物保藏中心目录上。而且，根据布达佩斯条约的条款，将AJ12340菌株保藏在作为国际保藏单位的国立生命科学和人体科学技术研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，Agency of IndustrialScience and Technology，Ministry of International Trade and Industry，1-3Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，postal code305-8566)。
除了前面提到的菌株之外，也可以将来自这些细菌菌株并能够产生L-氨基酸例如L-赖氨酸或L-谷氨酸的突变株用于本发明。这种人工突变株实例包括抗S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸(此后缩写为“AEC”)的突变株(例如乳发酵短杆菌AJ11082(NRRL B-11470)，参阅日本专利公告(KoKoKu)号56-1914、56-1915、57-14157、57-14158、57-30474、58-10075、59-4993、61-35840、62-24074、62-36673、5-11958、7-112437和7-112438)，其生长需要氨基酸例如L-高丝氨酸的突变株(日本专利公告号48-28078和56-6499)，抗AEC而且还需要氨基酸例如L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸的突变株(美国专利号3,708,395和3,825,472)，抗DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α-氨基-十二烷基内酰胺、天冬氨酸类似物、磺胺药物、醌式和N-十二烷基亮氨酸的L-赖氨酸生产突变株，抗草酰乙酸脱羧酶或呼吸道酶抑制剂的L-赖氨酸生产突变株(日本专利公开号50-53588、50-31093、52-102498、53-9394、53-86089、55-9783、55-9759、56-32995、56-39778，日本专利公告号53-43591和53-1833)，需要肌醇或乙酸的L-赖氨酸生产突变株(日本专利公开号55-9784和56-8692)，对氟代丙酮酸或34℃或更高温度敏感的L-赖氨酸生产突变株(日本专利公开号55-9783和53-86090)，抗乙二醇的短杆菌属或棒状杆菌属细菌的L-赖氨酸生产突变株(美国专利号4,411,997)等。
此外，作为具有L-苏氨酸生产能力的棒状杆菌还可列举嗜乙酰乙酸棒状杆菌AJ12318(FERM BP-1172)(参阅美国专利号5,188,949)等，作为具有L-异亮氨酸生产能力的棒状杆菌还可列举黄色短杆菌AJ12149(FERM BP-759)(参阅美国专利号4,656,135)。(2)增强果糖磷酸转移酶活性为了增强棒状杆菌细胞中的果糖磷酸转移酶活性，可以通过将编码果糖磷酸转移酶的基因片段和在所述细菌中起作用的载体(优选多拷贝载体)连接制备重组DNA，然后将其导入能够产生L-赖氨酸或L-谷氨酸的棒状杆菌中以使其转化。从而增加所述转化株细胞中编码果糖磷酸转移酶基因的拷贝数，因此增强果糖磷酸转移酶活性。在大肠杆菌中，果糖磷酸转移酶由fruA基因编码。
尽管果糖磷酸转移酶基因优选来自棒状杆菌的基因，但是也可以使用来自其他生物例如埃希氏菌属细菌的任何这样的基因。
已经阐明了大肠杆菌fruA基因的核苷酸序列(Genbank/EMBL/DDBJ编号M23196)，因此可以通过采用基于所述核苷酸序列制备的引物(例如，在序列表中表示为SEQ ID NO1和2的引物)和大肠杆菌染色体DNA用作模板进行PCR(聚合酶链式反应，参阅White，T.J.等人，Trends Genet.5，185(1989))，获得fruA基因。
此外，也可以如下获得棒状杆菌(例如乳发酵短杆菌)的fruA基因的部分序列选择与由已知fruA基因(例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌、生殖道支原体(Mycoplasma genitalium)和野油菜黄单胞菌(Xanthomonsa compestris)的fruA基因)预测的氨基酸序列具有高同源性的区段，根据该区段氨基酸序列制备用于PCR的引物，最后采用乳发酵短杆菌作为模板进行PCR。作为上述引物的实例，可以列举表示为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的寡核苷酸。
然后，利用如上所述获得的fruA基因部分序列，通过反向PCR(Genetics，120，621-623(1988))的方法、利用LA-PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)的方法等获得fruA基因的5’未知区段和3’未知区段。当使用LA-PCR体外克隆试剂盒时，可以通过例如第一PCR采用表示为SEQ ID NO5和9的引物进行而第二PCR采用表示为SEQID NO6和10的引物进行，获得fruA基因的3’未知区段。进一步，可以通过例如第一PCR采用表示为SEQ ID NO7和9的引物而第二PCR采用表示为SEQ ID NO8和10的引物进行，获得fruA基因的5’未知区段。包含如上所述获得的全长fruA基因的DNA片段的核苷酸序列表示为SEQ ID NO13。而且，从上述核苷酸序列推导的可读框翻译的氨基酸序列表示为SEQ ID NO14。
而且，因为本发明阐明了乳发酵短杆菌的fruA基因及其侧翼区的核苷酸序列，所以可以采用基于上述侧翼区核苷酸序列设计的寡核苷酸通过PCR获得包含全长fruA基因的DNA片段。
也可以通过相似方法获得其他细菌编码果糖磷酸转移酶的基因。
本发明的fruA基因可以是编码在一个或多个位点存在一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒置的果糖磷酸转移酶的基因，前提是所述编码蛋白质的果糖磷酸转移酶活性不降低。尽管“几个”氨基酸的数目在本文中根据氨基酸残基在所述蛋白质三维结构中的位置和类型而不同，但是它可以具体为2-200个，优选2-50个，更优选2-20个。
例如利用定点诱变方法修饰fruA核苷酸序列，从而应该在具体位点发生一个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒置，可以获得编码与上述果糖磷酸转移酶大体相同的蛋白质的DNA。也可以用常规已知诱变处理获得如上所述修饰DNA。所述诱变处理包括处理DNA后用羟胺等体外诱变处理的方法和处理包含DNA的微生物(例如埃希氏菌属细菌)后用紫外线照射或采用通常用于诱变处理的诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸进行诱变处理的方法。
可以在合适的细胞中表达具有如上所述的突变的DNA并检测表达产物的活性，从而确认编码与果糖磷酸转移酶大体上相同的蛋白质的DNA。也可以从编码突变果糖磷酸转移酶的DNA或含有该DNA的细胞分离下述DNA获得编码与果糖磷酸转移酶大体相同的蛋白质的DNA在严格条件下，与具有含例如对应于序列表SEQ ID NO13核苷酸序列中核苷酸号为881-2944的核苷酸序列或其部分的探针杂交的DNA，而且该DNA编码具有果糖磷酸转移酶活性的蛋白质。“严格条件”在本文中是指形成所谓特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。用任何数值都难以清楚表达这样的条件。然而，典型严格条件例如为高同源性DNA(例如同源性高于50％的DNA)彼此杂交而同源性低于50％的DNA则彼此间不杂交的条件。或者典型严格条件例如为DNA在相当于DNA杂交一般洗涤条件(即1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS)的盐浓度下于60℃彼此杂交的条件。
也可以使用SEQ ID NO13核苷酸序列的部分序列作为探针。可以采用基于SEQ ID NO13的核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物，而包含SEQ ID NO13的核苷酸序列的DNA片段作为模板，通过PCR制备所述探针。当使用长度约300bp的DNA片段作为探针时，杂交洗涤条件由例如50℃、2×SSC和0.1％SDS组成。
在如上所述条件下可杂交的基因包括在所述基因中含有终止密码子的基因和由于活性中心突变而没有活性的基因。然而，通过将每个基因与市售活性表达载体连接并采用Mori，M.& Shiio，I.，Agric.Biol.Chem.，51，129-138页(1987)中描述的方法检测果糖磷酸转移酶活性，可以容易区别上述基因。
编码与果糖磷酸转移酶大体上相同的蛋白质的DNA的具体实例包括编码与SEQ ID NO14所示的氨基酸序列的同源性优选为55％或更高，更优选为60％或更高，更优选为80％或更高并具有果糖磷酸转移酶活性的蛋白质的DNA。
例如应用Saito和Mirua的方法(参阅H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)；Text for Bioengineering Experiments，Society for Bioscience and Bioengineering(日本)主编，第97-98页，Baifukan，1992)等可以从DNA供体细菌制备染色体DNA。
如果通过PCR方法扩增的果糖磷酸转移酶编码基因与能在大肠杆菌和/或棒状杆菌细胞中自主复制的载体DNA连接制得重组DNA，并将重组DNA导入大肠杆菌中，则后继步骤就变得容易了。作为所述载体能在大肠杆菌细胞中自主复制，优选质粒载体，尤其是可在宿主细胞中自主复制的载体，所述载体的实例包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等。
能在棒状杆菌细胞中自主复制的载体实例包括pAM330(参阅日本专利公开号58-67699)、pHM1519(参阅日本专利公开号58-77895)等。而且，如果从这些载体中取出能够产生在棒状杆菌中自主复制的质粒的DNA片段，然后将其插入到上述的大肠杆菌载体中，则它们可以用作在大肠杆菌和棒状杆菌中均可自主复制的所谓的穿梭载体。这种穿梭载体的实例包括下面列举的穿梭载体。还分别指出了包含各种载体的微生物，以及在圆括号中列出了它们在国际保藏中心的保藏号。pAJ655 大肠杆菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒状杆菌SR8201(ATCC 39135)pAJ1844 大肠杆菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒状杆菌SR8202(ATCC 39136)pAJ611 大肠杆菌AJ11884(FERM BP-138)pAJ3148 谷氨酸棒状杆菌SR8203(ATCC 39137)pAJ440 枯草芽孢杆菌AJ11901(FERM BP-140)pHC4 大肠杆菌AJ12617(FERM BP-3532)为了通过将编码果糖磷酸转移酶的基因和可以在棒状杆菌细胞中起作用的载体连接制备重组DNA，用对应于编码果糖磷酸转移酶基因末端的限制酶消化所述载体。通常采用连接酶例如T4DAN连接酶进行连接。
为了将如上所述制备的重组DNA导入到微生物中，可以应用任何迄今报道的已知转化方法。例如，可以应用氯化钙处理接受细胞以提高对DNA通透性的方法，已经有关于大肠杆菌K-12的报道(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))；以及用生长期细胞制备感受态细胞然后导入所述DNA的方法，已经有关于枯草芽孢杆菌的报道(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，Gene，1，153(1977))。除此之外，也可以应用如下方法使DNA接受细胞成为容易摄入重组DNA的原生质体或原生质球，然后将所述重组DNA导入所述细胞，已知该方法适用于枯草杆菌、放线菌和酵母(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。在本发明列举的实施例中使用的转化方法是电脉冲法(参阅日本专利公开号2-207791)。
也可以通过在宿主染色体DNA中导入多个拷贝编码果糖磷酸转移酶的基因，从而增强果糖磷酸转移酶活性。为了在属于棒状杆菌的微生物染色体DNA中导入多个拷贝编码果糖磷酸转移酶的基因，采用在所述染色体DNA中存在多拷贝的序列作为靶序列进行同源重组。关于在所述染色体DNA中存在多拷贝的序列，可以使用存在于转座因子末端的重复DNA或反向重复序列。此外，如日本专利公开号2-109985所公开内容，也可以将编码果糖磷酸转移酶的基因导入转座子，使其转移从而将多拷贝所述基因导入染色体DNA中。按照任何一种上述方法，因为转化体菌株中的果糖磷酸转移酶编码基因拷贝数增加而增强果糖磷酸转移酶活性。
除了基于上述基因性增强之外，也可以用更强的表达调节序列替换表达调节序列染色体DNA或质粒上的表达序列例如果糖磷酸转移酶编码基因启动子(见日本专利公开号1-215280)。例如，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR启动子和PL启动子等是强启动子。取代这些启动子可增强果糖磷酸转移酶编码基因的表达，因此增强果糖磷酸转移酶活性。
在本发明的棒状杆菌中，除了果糖磷酸转移酶活性增强之外，也可以通过增强涉及另一种氨基酸生物合成途径或糖酵解系统中的另一种酶的基因而增强所述酶的活性。例如，可以用于生产L-赖氨酸的基因实例包括编码天冬氨酸激酶α-亚基蛋白或β-亚基蛋白的基因(其中L-赖氨酸和L-苏氨酸对所述天冬氨酸激酶α-亚基蛋白或β-亚基蛋白的协同反馈抑制作用被脱敏)(国际专利公开号WO94/25605)、得自棒状杆菌的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(日本专利公开号60-87788)、得自棒状杆菌的编码野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的基因(日本专利公告号6-55149)等。
进而可以用于生产L-谷氨酸的基因实例包括谷氨酸脱氢酶基因(GDH，日本专利公开号61-268185)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶(日本专利公开号62-166890和63-214189)、乌头酸水合酶(日本专利公开号62-294086)、柠檬酸合酶、丙酮酸羧化酶(日本专利公开号60-87788和62-55089)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、果糖磷酸转移酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶(日本专利公开号63-102692)、葡萄糖磷酸异构酶等。
此外，可以使从L-氨基酸生物合成途径分支催化产生需要L-氨基酸以外的化合物的反应的酶活性减弱或缺失。例如，从L-赖氨酸生物合成途径分支催化生成L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶实例包括高丝氨酸脱氢酶(参阅WO95/23864)。另外，从L-谷氨酸生物合成途径分支催化生成L-谷氨酸以外的化合物的反应的酶实例包括α-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、L-吡咯啉脱氢酶等。
而且，通过对具有L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌赋予对生物素作用抑制物质(例如表面活性剂)的温度敏感型突变，可以在包含过量生物素的培养基中在没有生物素作用抑制物质的情况下产生L-谷氨酸(参阅WO96/06180)。作为这种棒状杆菌的实例，可以提到WO96/06180中公开的乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)AJ13029菌株。AJ13029菌株于1994年9月2日保藏在国立生命科学和人体科学技术研究所(Naional Institute ofBioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology，1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，Japan，postal code305-8566)，保藏号为FERM P-14501，然后在1995年8月1日根据布达佩斯条约条款将其转移至国际保藏单位，保藏号为FERM BP-5189。
此外，通过对具有L-赖氨酸和L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌赋予对生物素作用抑制物质例如表面活性剂的温度敏感型突变，可以在包含过量生物素的培养基中在没有生物素作用抑制物质的情况下同时产生L-赖氨酸和L-谷氨酸(参阅WO96/06180)。作为这种棒状杆菌的实例，可以提到WO96/06180中公开的乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)AJ12933菌株。AJ12933菌株于1994年6月3日保藏在国立生命科学和人体科学技术研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，Agency of IndustrialScience and Technology，1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，Japan，postal code305-8566)，保藏号为FERM P-14348，然后在1995年8月1日根据布达佩斯条约条款将转移至国际保藏单位，保藏号为FERM BP-5188。(3)生产L-氨基酸如果在合适的培养基中培养果糖磷酸转移酶活性增强和L-氨基酸生产能力提高的棒状杆菌，则L-氨基酸在培养基中积累。例如，如果在合适的培养基中培养果糖磷酸转移酶活性增强和L-赖氨酸生产能力提高的棒状杆菌，则L-赖氨酸在培养基中积累。此外，如果在合适的培养基中培养果糖磷酸转移酶活性增强和L-谷氨酸生产能力提高的棒状杆菌，则L-谷氨酸在培养基中积累。
而且，如果在合适的培养基中培养果糖磷酸转移酶活性增强和L-赖氨酸及L-谷氨酸生产能力提高的棒状杆菌，则L-赖氨酸和L-谷氨酸在培养基中积累。当L-赖氨酸和L-谷氨酸同时发酵生产时，L赖氨酸生产菌可以在谷氨酸生产条件下培养，或者混合培养具有L-赖氨酸生产能力的棒状杆菌和具有L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌(日本专利公开号5-3793)。
用于采用本发明微生物生产L-氨基酸例如L-赖氨酸和L-谷氨酸的培养基是普通培养基，它包含碳源、氮源、无机离子和其他需要的有机痕量营养物质。作为碳源，可使用烃类例如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、赤糖糊和淀粉水解物；醇类例如乙醇和肌醇；或者有机酸例如乙酸、延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸。在本发明中，尤其优选其中的果糖。通常在采用棒状杆菌发酵生产L-氨基酸时，如果培养基采用果糖作为碳源，L-氨基酸产量往往降低。然而，用于本发明的微生物在包含果糖作为碳源的培养基中高效生产L-氨基酸。在L-赖氨酸生产中这种作用尤其明显。
作为氮源，可以使用无机铵盐或有机铵盐，例如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵、氨，有机氮例如蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆和大豆水解物、氨气、氨水等。
作为无机离子(或其来源)，加入少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。关于有机痕量营养物质，最好根据要求加入适量需要物质例如维生素B1、酵母提取物等。
优选在振摇、搅拌通气等达到需氧条件下培养16-72小时。在培养过程中，控制培养基温度为30℃-45℃，控制pH值为5-9。为调节这样的pH值，可以使用无机或有机酸性物质/碱性物质、氨气等。
可以采用与普通L-氨基酸生产方法相同的方法从发酵液中收集L-氨基酸。例如，通常可以通过结合常规技术进行L-赖氨酸收集，例如，利用离子交换树脂的方法、结晶等。而且，也可以用常规方法收集L-谷氨酸，例如利用离子交换树脂的方法、结晶等进行。具体而言，L-谷氨酸可以吸附在阳离子交换树脂上，因此将其分离，或通过中和结晶。当同时生产L-赖氨酸和L-谷氨酸并以混合物使用时，不必分开这两种氨基酸。
本发明的最佳实施方式下面参考以下实施例更具体地解释本发明。实施例1构建导入fruA基因的棒状杆菌(1)克隆大肠杆菌JM109菌株fruA基因已经阐明了大肠杆菌fruA基因的核苷酸序列(Genbank/EMBL/DDBJ编号M23196)。根据报道的核苷酸序列合成序列表中表示为SEQ ID NO1和2的引物，并利用大肠杆菌JM109菌株染色体DNA作为模板通过PCR扩增果糖磷酸转移酶基因。
在所合成的引物中，SEQ ID NO1核苷酸序列对应于Genbank/EMBL/DDBJ编号M23196的fruA基因核苷酸序列中从第1到第24位核苷酸的序列，SEQ ID NO2核苷酸序列对应于相同核苷酸序列第2000到第1977位核苷酸的序列。
通过常规方法制备大肠杆菌JM109菌株的染色体DNA(Text forBioengineering Experiments，Society for Bioscience andBioengineering(日本)主编，第97-98页，Baifukan，1992)。PCR标准反应条件见“Forefront of PCR”第185页(Takeo Sekiya等人编制，Kyoritsu Shuppan，1989)。
用常规方法纯化产生的PCR产物，然后采用连接试剂盒(TakaraShuzo)将其与SmaI消化的质粒pHC4连接，最后用于转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)的感受态细胞。将所述细胞接种在包含30μg/ml氯霉素的L培养基(10g/L细菌培养用胰蛋白胨、5g/L细菌培养用酵母提取物、5g/L NaCl、15g/L琼脂、pH7.2)上，培养过夜。然后，挑取形成的白色菌落，将其分离为单一菌落以获得转化体菌株。从获得的转化体菌株中提取质粒，获得包含与所述载体连接的fruA基因的质粒pHC4fru。
含有pHC4的大肠杆菌(Escherichia coli)的私人编号为AJ12617，于1991年4月24日保藏在国立生命科学和人体科学技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of International Trade andIndustry，1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，postalcode305-8566)，保藏号为FERM P-12215。然后，在1991年8月26日根据布达佩斯条约条款把它转移至国际保藏单位，保藏号为FERMBP-3532。
然后，为了证明所克隆的DNA片段编码的蛋白质具有果糖磷酸转移酶活性，通过Mori，M.& Shiio，I.，Agric.Biol.Chem.，51，129-138(1987)中描述的方法检测JM109菌株以及含有pHC4fru的JM109菌株的果糖磷酸转移酶活性。结果证实，与不含有pHC4fru的JM109菌株相比，含有pHC4fru的JM109菌株的果糖磷酸转移酶活性高出约11倍，因此证实表达了fruA基因。
(2)将pHC4fru导入棒状杆菌L-谷氨酸生产菌株并生产L-谷氨酸用质粒pHC4fru通过电脉冲法(参阅日本专利公开号2-207791)转化乳发酵短杆菌AJ13029，以获得转化体菌株。采用所获得的转化体菌株AJ13029/pHC4fru如下培养生产L-谷氨酸。将在含有5μg/ml氯霉素的CM2B平皿培养基上培养之后获得的AJ13029/pHC4fru菌株细胞接种到包含5μg/ml氯霉素的具有以下组分的L-谷氨酸生产培养基中，在31.5℃下振摇培养至培养基中的糖耗尽。将所获得的培养物以5％的量接入到具有相同组合物的培养基中，并在37℃摇动培养至培养基中的糖耗尽。作为对照，用能够在棒状杆菌属细菌中自主复制的先前获得的质粒pHC4通过电脉冲法转化的棒状杆菌AJ13029菌株，用与上述相同的方法培养。
将以下成分溶解(1L)，用KOH调节pH至8.0，在115℃灭菌15分钟。果糖 150gKH2PO42gMgSO4·7H2O 1.5gFeSO4·7H2O 15mgMnSO4·4H2O 15mg大豆蛋白水解液 50mL生物素 2mg盐酸硫胺素 3mg完成培养后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产的BiotechAnalyer AS-210检测培养液中积累的L-谷氨酸量。结果见表1。
表1
(3)将pHC4fru导入棒状杆菌L-赖氨酸生产菌株并生产L-赖氨酸用质粒pHC4fru通过电脉冲法(参阅日本专利公开号2-207791)转化乳发酵短杆菌AJ11082菌株，以获得转化体菌株。采用所获得的转化体菌株AJ11082/pHC4fru如下培养生产L-赖氨酸。将在含有5μg/ml氯霉素的CM2B平皿培养基上培养之后获得的AJ11082/pHC4fru菌株细胞接种到包含5μg/ml氯霉素的具有以下组成的L-赖氨酸生产培养基中，在31.5℃下振摇培养至培养基中的糖耗尽。作为对照，用能够在棒状杆菌属细菌中自主复制的先前获得的质粒pHC4通过电脉冲法转化的棒状杆菌AJ11082菌株，用与上述相同的方法培养。
1981年1月31，将乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)AJ11082保藏在国际保藏单位农业研究机构保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection，1815 N.UniversityStreet，Peoria，Illinois 61604美国)，保藏号为NRRL B-11470。
将以下成分溶解(1L)，用KOH调节pH至8.0，在115℃灭菌15分钟，然后添加独立于热灭菌的碳酸钙。果糖 100g(NH4)2SO455gKH2PO41gMgSO4·7H2O 1g生物素 500μg硫胺 2000μgFeSO4·7H2O 0.01gMnSO4·4H2O 0.01g烟碱 5mg蛋白水解物(大豆乳) 30mL碳酸钙 50g完成培养后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产的BiotechAnalyer AS-210检测培养液中积累的L-赖氨酸量。结果见表2。
表2
(4)将pHC4fru导入棒状杆菌L-赖氨酸和L-谷氨酸生产菌株中并同时生产L-赖氨酸和L-谷氨酸用质粒pHC4fru通过电脉冲法(参阅日本专利公开号2-207791)转化乳发酵短杆菌AJ12993菌株，以获得转化体菌株。采用所获得的转化体菌株AJ12993/pHC4fru如下培养生产L-赖氨酸和L-谷氨酸。将在含有5μg/ml氯霉素的CM2B平皿培养基上培养之后获得的AJ12993/pHC4fru菌株细胞接种到包含5μg/ml氯霉素的上述L-赖氨酸生产培养基中，在31.5℃下培养。从培养开始12小时后，培养温度转换为34℃，进一步继续振摇培养直到培养基中的糖耗尽。作为对照，用能够在棒状杆菌属细菌中自主复制的先前获得的质粒pHC4通过电脉冲法转化的棒状杆菌AJ12993菌株，用与上述相同的方法培养。
完成培养后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产的BiotechAnalyer AS-210检测培养液中积累的L-赖氨酸和L-谷氨酸的量。结果见表3。
表3
实施例2分离乳发酵短杆菌fruA基因(1)获得乳发酵短杆菌ATCC13869的fruA基因部分片段选择在枯草杆菌、大肠杆菌、生殖道支原体和野油菜黄单胞菌的FruA氨基酸序列中具有高度同源性的区段，根据该区段氨基酸序列推导核苷酸序列，合成表示为SEQ ID NO3和4的寡核苷酸。另外采用细菌基因组DNA纯化试剂盒(Advanced Genetic Technologies公司)制备乳发酵短杆菌ATCC13869菌株的染色体DNA。加入无菌水至0.5μg的染色体DNA、每种寡核苷酸20pmol、4μl dNTP混合物(dATP、dGTP、dCTP、dTTP，各2.5mM)、5μl 10x ExTaq缓冲液(Takara Shuzo)和1U ExTaq(Takara Shuzo)中，制备总体积为50μl的PCR反应混合物。对这种反应混合物，使用Thermal Cycler TP 240(Takara Shuzo)，进行25个循环的PCR，每个循环为98℃变性10秒、45℃退火30秒和72℃延伸90秒，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果发现反应混合物含有大约1.2kb的电泳带。
采用Original TA Cloning Kit(Invitrogen)将所述反应产物与pCR2.1(Invitrogen)连接。连接后，用所述连接混合物转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)的感受态细胞，然后平板接种在包含10μg/mlIPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)、40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)和25μg/ml卡那霉素的L培养基(10g/L的细菌培养用蛋白胨、5g/L细菌培养用酵母提取物、5g/L NaCl、15g/L琼脂，pH7.2)上，培养过夜。然后，挑取形成的白色菌落，分离成单菌落以获得转化体菌株。
采用碱法(Text for Bioengineering Experiments，Society forBioscience and Bioengineering(日本)主编，第105页，Baifukan，1992)由获得的转化体菌株制备质粒，采用表示为SEQ ID NO5和6的寡核苷酸通过Sanger方法(J.Mol.Biol.，143，161(1980))测定插入片段两端的核苷酸序列。具体而言，使用Big Dye Terminator Sequencing Kid(Applied Biosystems)进行核苷酸序列测定，采用Genetic Analyzer ABI310(Applied Biosystems)进行分析。将所测定的核苷酸序列翻译为氨基酸序列，并将它与从枯草杆菌、大肠杆菌、生殖道支原体和野油菜黄单胞菌的fruA基因推导的氨基酸序列比较。结果证实具有高度同源性，从而确定所克隆的片段是来自乳发酵短杆菌的fru4基因。
(2)测定乳发酵短杆菌ATCC13869fruA基因的完整核苷酸序列上述(1)制备的包含于质粒中的片段是frua基因的部分片段，因此还需要测定全长fruA基因的核苷酸序列。尽管用于测定已知区段侧翼的未知核苷酸序列的方法有反向PCR(Genetics，120，621-623(1998))、利用LA-PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo)的方法等，然而在本实施例中采用LA-PCR体外克隆试剂盒测定未知序列。具体而言，基于上述(1)测定的核苷酸序列合成表示为SEQ ID NO7、8、9和10的寡核苷酸，按照LA-PCR体外克隆试剂盒的方法进行测定。
对于fruA基因部分片段的3’未知区段，用HindIII处理乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA，使其与所述试剂盒包含的HindIII接头连接，然后第一PCR采用SEQ ID NO7和11寡核苷酸进行，第二PCR采用SEQ ID NO8和12寡核苷酸进行。当对该PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳时，观察到大约700 bp的电泳带。采用Suprecver.2(Takara Shuzo)提纯该电泳带，采用SEQ ID NO8和12的寡核苷酸以与(1)描述的相同方法测定包含于700bp PCR产物中的fruA基因核苷酸序列。
对于fruA基因部分片段的5’未知区段，用BamHI处理乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA，将其与所述试剂盒包含的Sau3AI接头连接，然后第一PCR采用SEQ ID NO9和11的寡核苷酸进行，第二PCR采用SEQ ID NO10和12寡核苷酸进行。当该PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳时，观察到大约1500bp的电泳带。采用Suprec ver.2(Takara Shuzo)提纯该电泳带，采用SEQ ID NO10和12寡核苷酸通过与(1)中描述的相同方法测定包含于该1500bp PCR产物中fruA基因核苷酸序列。
关于上述测定的核苷酸序列，包含fruA基因的大约3380bp的核苷酸序列在序列表中表示为SEQ ID NO13。通过翻译从上述核苷酸序列推导的可读框而获得的氨基酸序列表示为SEQ ID NO14。也就是说，序列表中SEQ ID NO14氨基酸序列组成的蛋白质是乳发酵短杆菌ATCC13869菌株的FruA。另外，众所周知，蛋白质N-末端的蛋氨酸残基作为起始密码子启始于ATG，因此它与蛋白质正常功能无关，在许多情况下翻译之后通过肽酶作用除去。前面提到的蛋白质也可能除去该蛋氨酸残基。
比较上述核苷酸序列和氨基酸序列与已知序列的同源性。所使用的数据库是GeneBank和SWISS-PROT。结果发现，序列表中表示为SEQ ID NO13的DNA是棒状杆菌属细菌的新型基因，与已经报道的fruA基因具有同源性。
作为编码氨基酸，表示为SEQ ID NO13的DNA与枯草杆菌、大肠杆菌、生殖道支原体和野油菜黄单胞菌fruA的同源性分别为42.1％、51.0％、37.4％和45.5％。采用Genetyx-Mac计算机程序(SoftwareDevelopment，东京)分析所述核苷酸序列和氨基酸序列。按照Lipman和Peason的方法(Science，227，1435-1441，1985)进行同源性分析。
工业实用性按照本发明可以提高棒状杆菌的L-氨基酸例如L-赖氨酸或L-谷氨酸的生产能力。按照本发明还提供得自乳发酵短杆菌的新型果糖磷酸转移酶基因。该基因可优选培育适合生产L-氨基酸的棒状杆菌。
序列表<110>Ajinomoto Co.，Inc.<120>生产L-氨基酸的方法和新型基因<130>B699MSOP1116<141>2000-12-22<150>JP 11-368096<151>1999-12-24<160>14<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于扩增大肠杆菌fru基因的引物<400>1agctgttgca gccctggcgg taag 24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于扩增大肠杆菌fru基因的引物<400>2aacaataaaa aagggcagaa aata 24<210>3<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆fruA的引物1<220><221>misc feature<222>(18)<223>n＝a或g或c或t<400>3tgcccwaccg gyatygcnca caccttcatg gc 32<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于克隆fruA的引物2<220><221>misc feature<222>(3，15)<223>n＝a或g或c或t<400>4gcngcgaasg gratngcrcc ytc 23<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于测序的引物M13-20<400>5gtaaaacgac ggccag 16<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于测序的引物M13RV<400>6caggaaacag ctatgac 17<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR的引物F3-1<400>7gctaccctgc tgcgcaagaa gctgttcacc 30<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述用于PCR的引物F3-2<400>8agagcaagaa aacggcaagt cttcctggct gc 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权利要求
1.一种棒状杆菌，该棒状杆菌的细胞内果糖磷酸转移酶活性增强而且L-氨基酸生产能力提高。
2.权利要求
1的棒状杆菌，其中所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸。
3.权利要求
1的棒状杆菌，其中所述果糖磷酸转移酶活性通过增加所述细菌细胞中的果糖磷酸转移酶编码基因拷贝数得到增强。
4.权利要求
3的棒状杆菌，其中所述果糖磷酸转移酶编码基因得自埃希氏菌属(Escherichia)细菌。
5.权利要求
3的棒状杆菌，其中所述果糖磷酸转移酶编码基因得自棒状杆菌。
6.一种生产L-氨基酸的方法，该方法包含以下步骤在培养基中培养权利要求
1-5任一项的棒状杆菌，从而在培养物中产生并积累所述L-氨基酸，以及从培养物中收集所述L-氨基酸。
7.权利要求
6的方法，其中所述L-氨基酸选自L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-丝氨酸。
8.权利要求
6或7的方法，其中所述培养基包含果糖作为碳源。
9.一种DNA，它编码以下(A)或(B)定义的蛋白质(A)具有序列表SEQ ID NO14氨基酸序列的蛋白质，(B)具有存在一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒置的序列表SEQ ID NO14氨基酸序列的蛋白质，而且该蛋白质具有果糖磷酸转移酶活性。
10.权利要求
9的DNA，它是以下(a)或(b)定义的DNA(a)包含序列表SEQ ID NO13核苷酸序列中核苷酸号为881-2499的核苷酸序列的DNA，(b)在严格条件下与序列表SEQ ID NO13核苷酸序列中核苷酸号为881-2499的核苷酸序列或者与用所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，而且该DNA编码具有果糖磷酸转移酶活性的蛋白质。
专利摘要
将果糖磷酸转移酶编码基因导入能够产生L－氨基酸如L－赖氨酸或L－谷氨酸的棒状杆菌中，从而增强果糖磷酸转移酶活性，因此提高L－氨基酸生产能力。
文档编号C12N15/54GKCN1434860SQ00819106
公开日2003年8月6日 申请日期2000年12月22日
发明者杉本雅一, 中井勇太, 伊藤久生, 倉桥修 申请人:味之素株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan