专利名称:反义寡核苷酸的制作方法
本发明涉及反义寡核苷酸及其在抑制I型原胶原表达中的用途。
胶原是一个密切相关蛋白的家族，具有三股螺旋蛋白结构。已经鉴定了许多胶原型(＞10)，其中I型原胶原(包括两条α1链和一条α2链)是骨、皮肤和键的主要成分。
多年来已经认识到许多病理状态是由于在瘢痕形成过程中产生过多胶原和过量的纤维组织造成的。例如，肝硬化包括两个步骤，其中正常肝组织首先被一种病毒或被乙醇或其它毒素破坏，接着在正常肝细胞再生前，过量的胶原纤维代替了被破坏细胞。特发性肺纤维化是一种正常肺组织逐渐被过量的胶原纤维代替的致命情况。进行性系统硬化症(硬皮病)是一种常常致命的疾病，皮肤和许多内脏器官由于过量的胶原纤维沉积而变为皮革样。在很多个体中，皮肤伤口或手术切口在肥大瘢痕和瘢痕疙瘩形成中伴随过量的胶原沉积，出现了美容问题，有时还有更严重的后果。而且，过量的瘢痕形成常常在正常个体外伤和手术操作后发生。在这些和相关的情况下，一种特异性抑制胶原合成的方法和组合物将非常有益。
PCT专利申请公开号WO94/11494公开了一种DNA或RNA寡核苷酸，包括5到200个核苷酸，它与突变型胶原核苷酸序列或正常野生型胶原核苷酸序列基本互补，能够抑制胶原基因表达。据称优选的寡核苷酸是反义寡核苷酸。WO94/11494的实施例描述了一系列DNA寡核苷酸，其中一些是反义的，这一系列寡核苷酸是根据人I型原胶原基因(COL1A1)的proα1链的外显子1的3’末端区域(从核苷酸198到222)和内含子1的起始两个核苷酸首先合成的。发现合成的寡核苷酸对人源内部缺失突变型COL1A1基因表达的抑制能力变化很大。然而没有证明该寡核苷酸抑制人野生型COL1A1基因表达的效力。由于人突变型和野生型COL1A1基因的RNA转录物的结构和构象很可能不同，不能必然认为能有效抑制突变型COL1A1基因表达的寡核苷酸也会是野生型COL1A1基因表达的有效抑制剂。
期望鉴定出能够抑制一种野生型COL1A1基因表达的反义DNA寡核苷酸。
因此根据本发明，提供了一种反义DNA寡核苷酸，包括18到25个核苷酸，它与SEQ ID NO1中750位到3900位包括750位和3900位的核苷酸序列互补，其中SEQ ID NO1包括编码包含根据SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，该寡核苷酸能够抑制该多肽在表达该多肽的细胞中的表达。
SEQ ID NO1与EMBL注册号Z74615注册的核苷酸序列等同。SEQID NO2是核苷酸序列SEQ ID NO1编码的多肽的氨基酸序列。SEQ IDNO1编码的多肽是野生型I型原胶原的proα1链的前体(“前原-α1(I)胶原”)。
根据本发明的反义DNA寡核苷酸包括18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，优选长度为20个核苷酸。
优选反义DNA寡核苷酸与SEQ ID NO1的下列区域之一的核苷酸序列互补，区域1-750位到900位，包括750位和900位，区域2-1200位到1300位，包括1200位和1300位，区域3-1400位到1500位，包括1400位和1500位，区域4-1450位到1550位，包括1450位和1550位，区域5-1850位到2000位，包括1850位和2000位，区域6-2500位到2600位，包括2500位和2600位，区域7-2850位到2950位，包括2850位和2950位，区域8-3800位到3900位，包括3800位和3900位。
特别优选的反义DNA寡核苷酸是与SEQ ID NO1的区域2、4、6和8的核苷酸序列互补的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸可以通过任何本领域已知的合适方法制备。通过化学合成方法能非常方便地制备该寡核苷酸，例如，Tetrahedron Lett.，1991，32，30005-30008中描述的亚磷酰胺化学过程，用二硫化四乙基秋兰姆对乙腈进行硫化。
本发明的寡核苷酸具有优越性，因为它们抑制野生型COL1A1基因的表达。因此它们在治疗或预防由胶原纤维产生过多而引起的状态/紊乱中有用，如，肝硬化、肾、肝和心脏纤维化、硬皮病、肥大瘢痕和瘢痕疙瘩。
因此，本发明提供了一种根据本发明用于治疗的反义DNA寡核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了根据本发明的反义DNA寡核苷酸在制备用于治疗的药物中的应用。
在本发明的说明书中，术语“治疗”也包括“预防”，除非有特别的相反指示。术语“治疗的”和“治疗地”应据此解释。
本发明进一步提供了一种治疗患有胶原紊乱或存在胶原紊乱风险患者的胶原紊乱，或降低胶原紊乱风险的方法，包括给患者施与治疗有效量的根据本发明的反义DNA寡核苷酸。
当然，对于上面提及的治疗用途中使用的剂量将根据所使用的寡核苷酸、给药方式、期望的治疗和紊乱指征而发生变化。有效的剂量是能够将细胞中产生的胶原蛋白量抑制在可消除或减少胶原蛋白产生伴发的症状或情况的水平。
根据本发明的寡核苷酸通常以药物组合物的形式给予，其中寡核苷酸与一种药学上可接受佐剂、稀释液或载体配制而成。
因而，本发明也提供了一种药物组合物，包括根据本发明的反义DNA寡核苷酸联合一种药学上可接受佐剂、稀释液或载体。
本发明进一步提供了一种本发明药物组合物的制备方法，包括将反义DNA寡核苷酸与一种药学上可接受佐剂、稀释液或载体混合。
本发明的药物组合物可以局部给予，如，以乳剂、洗剂或软膏的形式；或全身给予，如以药片、胶囊、糖浆、粉剂或粒剂的形式口服给药，或以无菌溶液或悬液的形式肠胃外途径给药。
现在将参考下列例证实施例来进一步解释本发明。
实施例实施例1寡核苷酸的合成在PE生物系统394 DNA合成仪上，用TETD/乙腈硫化试剂采用亚磷酰胺化学过程进行1μm规模的硫代磷酸寡核苷酸合成。Poly-Pak TM II柱(Glen Research)纯化寡核苷酸，NAPTM 10柱(Amersham PharmaciaBiotech AB)除去盐分并用Dowex 50WX8-100离子交换树脂(Aldrich)进行离子交换。制备的12个反义DNA寡核苷酸(ASOs)具有下列序列(5’→3’)1.GGACGACCAGGTTTTCCAGC(SEQ ID NO3)2.GCAGCACCAGCAGGGCCAGG(SEQ ID NO4)3.GCCAGGAGCACCAGGTTCAC(SEQ ID NO5)4.CTTCCTCTCCAGCAGGGCCA(SEQ ID NO6)5.GCCTTGCCGGGCTCTCCAGC(SEQ ID NO7)6.CGGGAACACCTCGCTCTCCA(SEQ ID NO8)7.GCAGGACCGACAGCGCCAGG(SEQ ID NO9)8.TCCATCTTTGCCAGCAGGAC(SEQ ID NO10)9.GGTCCCTGAGCTCCAGCCTC(SEQ ID NO11)10.TTGGCCGTCAGCACCAGGG(SEQ ID NO12)11.TTTCTCGCCAGCAGGGCCAG(SEQ ID NO13)12.CTCGATCTGCTGGCTCAGGC(SEQ ID NO14)实施例2细胞处理人细胞系WI-26在含有10％胎牛血清的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM)中生长。将细胞铺在48-孔或6-孔平板(Costar，ComingInc.)上达到70-80％融合。24小时后，用预热的DMEM洗涤细胞2次，每孔加入含有5μg/ml脂转染试剂(Gibco BRL)或2.5μg/ml细胞转染试剂GSV(Glen Research Ltd)的0.35ml(对于48-孔试验)或1ml(6-孔试验)DMEM和200nM的寡核苷酸。37℃培养4-5小时后，用预热的DMEM洗涤细胞2次，0.35ml(48-孔平板)或1ml(6-孔平板)DMEM与20μg/ml抗坏血酸一起加入。细胞培养20小时后分析胶原水平。
实施例3蛋白分析试验最后，去除150μl培养基，用ELISA试剂盒(Amersham PharmaciaLtd)测定分泌的I型原胶原，结果以培养基中原胶原的纳克数/10,000细胞表示。为了校正细胞数量，用预热PBS洗涤平板，胰蛋白酶处理细胞，用Coulter自动计数器计算细胞数量。对于6-孔试验，细胞计数，用1mlTRI试剂(SIGMA Ltd)处理细胞，根据厂商说明提取蛋白和RNA。蛋白团在含蛋白酶抑制剂的1％SDS中重悬。100℃加热30-100μg细胞蛋白5分钟，接着在4-12％SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳。蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，并与抗人I型胶原proα1(I)链(从Dr Larry Fisher，NIH，美国获得)相应合成肽的抗体杂交。用偶合HRP(Biorad Ltd)的抗-兔二抗检测proα1(I)带，ECL(Pierce Ltd)显影。用GAPDH的抗体(AdvancedImmunochemicals)处理膜，测定蛋白加样。用光密度测定法将蛋白加样标准化至GAPDH水平。
实施例4RNA分析用TRI试剂提取RNA，0.5％SDS中重悬最终的颗粒团。根据标准步骤(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)Molecular CloningALaboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，冷泉港，美国)，总RNA的1到3μg在甲醛变性胶中电泳。RNA转移至Hybond-N膜(Amersham)上，使用T7聚合酶试剂盒(Amersham Pharmacia)与α1(I)cDNA放射性标记探针杂交24小时。洗涤后，滤光片曝光为X-线胶片，4-24小时后胶片显影。用光密度测定分析法分析α1(I)转录物(4.8kb&5.8kb)的放射自显影图象，用GAPDH转录物强度或作为内对照的28SrRNA的强度来校正RNA加样。
结果下表I显示有关培养基中胶原水平或胶原mRNA水平的胶原抑制平均百分比(％)。在所使用的处理细胞试验中，培养基中测定的胶原抑制百分比与细胞内胶原mRNA水平的抑制百分比之间有很好的相关性。
表I
序列表序列表<110>阿斯特拉曾尼卡有限公司(AstraZeneca AB)<120>反义寡核苷酸<130>Z70611<140><141><160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>6728<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(120)..(4511)<220><221>信号肽<222>(120)..(185)<300><308>EMBL/Z74615<309>1996-07-01<400>1agcagacggg agtttctcct cggggtcgga gcaggaggca cgcggagtgt gaggccacgc 60atgagcggac gctaaccccc tccccagcca caaagagtct acatgtctag ggtctagac 119atg ttc agc ttt gtg gac ctc cgg ctc ctg ctc ctc tta gcg gcc acc 167Met Phe Ser Phe Val Asp Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Thr1 5 10 15gcc ctc ctg acg cac ggc caa gag gaa ggc caa gtc gag ggc caa gac 215Ala Leu Leu Thr His Gly Gln Glu Glu Gly Gln Val Glu Gly Gln Asp20 25 30gaa gac atc cca cca atc acc tgc gta cag aac ggc ctc agg tac cat 263Glu Asp Ile Pro Pro Ile Thr Cys Val Gln Asn Gly Leu Arg Tyr His35 40 45gac cga gac gtg tgg aaa ccc gag ccc tgc cgg atc tgc gtc tgc gac 311Asp Arg Asp Val Trp Lys Pro Glu Pro Cys Arg Ile Cys Val Cys Asp50 55 60aac ggc aag gtg ttg tgc gat gac gtg atc tgt gac gag acc aag aac 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权利要求
1一种反义DNA寡核苷酸，包括18到25个核苷酸，它与SEQ IDNO1中750位到3900位包括750位和3900位的核苷酸序列互补，其中SEQ ID NO1包括编码包含根据SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，该寡核苷酸能够抑制该多肽在表达该多肽的细胞中的表达。
2.根据权利要求
1的寡核苷酸，它与SEQ ID NO1中750位到900位包括750位和900位的核苷酸序列互补。
3.根据权利要求
1的寡核苷酸，它与SEQ ID NO1中1200位到1300位包括1200位和1300位的核苷酸序列互补。
4.根据权利要求
1的寡核苷酸，它与SEQ ID NO1中1400位到1500位包括1400位和1500位的核苷酸序列互补。
5.根据权利要求
1的寡核苷酸，它与SEQ ID NO1中1450位到1550位包括1450位和1550位的核苷酸序列互补。
6.根据权利要求
1的寡核苷酸，它与SEQ ID NO1中1850位到2000位包括1850位和2000位的核苷酸序列互补。
7.根据权利要求
1的寡核苷酸，它与SEQ ID NO1中2500位到2600位包括2500位和2600位的核苷酸序列互补。
8.根据权利要求
1的寡核苷酸，它与SEQ ID NO1中2850位到2950位包括2850位和2950位的核苷酸序列互补。
9.根据权利要求
1的寡核苷酸，它与SEQ ID NO1中3800位到3900位包括3800位和3900位的核苷酸序列互补。
10.根据权利要求
1的寡核苷酸，它选自SEQ ID NO3、SEQ IDNO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13和SEQ ID NO14。
11.一种药物组合物，包括权利要求
1至10任一项限定的寡核苷酸与药学上可接受的佐剂、稀释液或载体。
12.一种权利要求
11的药物组合物的制备方法，包括将权利要求
1至10任一项限定的寡核苷酸与药学上可接受的佐剂、稀释液或载体混合。
13.根据权利要求
1至10任一项的寡核苷酸用于治疗。
14.根据权利要求
1至10任一项的寡核苷酸在制备用于治疗的药物中的应用。
15.一种治疗患有胶原紊乱或存在胶原紊乱风险患者的胶原紊乱，或降低胶原紊乱风险的方法，包括给患者施与治疗有效量的权利要求
1至10任一项限定的寡核苷酸或权利要求
11限定的药物组合物。
专利摘要
本发明提供了能有效抑制野生型COL1A1基因表达的反义DNA寡核苷酸。
文档编号C12N15/09GKCN1423695SQ00817282
公开日2003年6月11日 申请日期2000年12月12日
发明者R·贝里 申请人:阿斯特拉曾尼卡有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan