专利名称:生产l－赖氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过发酵生产L-赖氨酸的方法，其作为一种饲料添加剂或其它类似物方面具有广泛的用途。
技术背景通过具有生产L-赖氨酸能力的短杆菌属和棒杆菌属的杆状细菌发酵来生产L-赖氨酸已经进入工业化。这些棒状细菌的从自然界分离的菌株或人工突变体菌株已被使用。
通过重组DNA技术来增加L-赖氨酸生物合成酶的活性以提高L-赖氨酸的产率的各种技术已经被完全公开。例如，众所周知棒状细菌可以产生L-赖氨酸，该种细菌的L-赖氨酸的生产率的提高是通过导入编码L-赖氨酸和苏氨酸反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶的基因(突变体lysC)，二氢2，6-吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)，二氢2，6-吡啶二羧酸合成酶(dapA)，二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)和二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(WO96/40934)；lysA和ddh(日本专利公开号9-322774)；lysC，lysA和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(日本专利公开号10-165180)；或突变体lysC，dapB，dapA，lysA和天冬氨酸氨基转移酶基因(aspc)(日本专利公开号10-2158)而实现的。
另一方面，众所周知当大肠杆菌产生的6-磷酸果糖激酶(在下文中简称为“磷酸果糖激酶”)导入到细菌(日本专利公开号63-102692)中时，棒状细菌的L-谷氨酸产率也将被提高。
然而，在磷酸果糖激酶的活性和L-赖氨酸产率之间没有已知的联系。
另外，棒状细菌的编码磷酸果糖激酶的基因的结构还不清楚。
发明内容
本发明的一个目的是为了提供一种通过发酵有效生产L-赖氨酸的方法，和在该方法中使用的细菌和DNA。
本发明人认真的研究以解决上述问题。因此，他们发现L-赖氨酸的产量能够通过磷酸果糖激酶编码基因导入棒状细菌增加磷酸果糖激酶的活性来提高。而且，他们成功地从乳发酵短杆菌分离出一种新的磷酸果糖激酶。在上述发现的基础上完成了本发明。
因此，本发明提供如下1)一种棒状细菌，这种棒状细菌细胞内的6-磷酸果糖激酶的活性得到增加，而且有产生L-赖氨酸的能力。
2)按照(1)所述的棒状细菌，通过在该细菌细胞内增加6-磷酸果糖激酶编码基因的拷贝数，提高6-磷酸果糖激酶的细胞内活性。
3)根据(2)所述的棒状细菌，其中6-磷酸果糖激酶编码基因来自棒状细菌。
4)生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤在培养基中培养在(1)到(3)所限定的棒状细菌、在培养基中生产和积累L-赖氨酸并从培养基中收集L-赖氨酸。
5)编码以下(A)或(B)限定的蛋白质的DNA(A)具有SEQ ID NO12氨基酸序列的蛋白质，或(B)具有SEQ ID NO12氨基酸序列并且其中包括一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、增加或倒位的蛋白质，并且具有6-磷酸果糖激酶活性。
6)根据(5)所述的DNA，其为以下(a)或(b)限定的DNA(a)具有包含SEQ ID NO11从第116到第1153号核苷酸的核苷酸序列的DNA；或(b)在严紧条件下，可与具有包含SEQ ID NO11从第116到第1153号核苷酸的核苷酸序列的DNA或其部分杂交并且编码具有6-磷酸果糖激酶活性的蛋白质的DNA。
实施本发明的最佳方式本发明详细描述如下。
<1>本发明的棒状细菌本发明的棒状细菌具有L-赖氨酸生产能力，细胞内磷酸果糖激酶活性得到增强。磷酸果糖激酶活性催化磷酸基团转移至果糖6-磷酸的位置1的。
本发明的棒状细菌是Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，8th ed.，p.599(1974)限定的一组微生物，它们是好氧的、革兰氏阳性、非抗酸性的、没有形成孢子的能力的杆菌。这种棒状细菌包括属于短杆菌属的细菌，此前它们被归入短杆菌属但是现在已经归为棒杆菌属(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，以及与属于棒杆菌属的细菌密切相关的属于短杆菌属和微杆菌属的细菌。例如适于用来生产L-赖氨酸的棒状细菌的例子包括如下述菌株嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870；醋谷棒杆菌ATCC 15806；美棒杆菌ATCC 15991；谷氨酸棒杆菌ATCC 13032；(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020；(乳发酵短杆菌)ATCC 13869；(百合花棒杆菌)ATCC 15990；(黄色短杆菌)ATCC 14067；Corynebacterium melassecola ATCC 17965；解糖短杆菌ATCC 14066；Brevibacterium immariophilum ATCC 14068；玫瑰色短杆菌ATCC 13825；生硫短杆菌ATCC 19240；嗜胺微杆菌ATCC 15354；Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539).
这些菌株系列能够从例如美国典型培养物保藏中心得到。每一种微生物都有保藏号，人们能够根据保藏号要求提供每一种微生物。对应于这些微生物的保藏号在美国典型培养物保藏中心目录中有描述。根据布达佩斯条约，AJ12340菌株保存在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所。
除了上面描述的细菌菌株，从这些菌株衍生的有L-赖氨酸生产能力的突变菌株也可用于本发明。这样的人工突变菌株如下S-(2-氨乙酸)-半胱氨酸(缩写AEC)抗性突变菌株(例如，乳发酵短杆菌AJ11082(NRRL B-11470)；见日本专利公告号56-1914，56-1915，57-14157，57-14158，57-30474，58-10075，59-4993，61-35840，62-24074，62-36673，5-11958，7-112437，和7-112438)；乳发酵短杆菌AJ11082(NRRL B-11470)；见日本专利公告号56-1914，56-1915，57-14157，57-14158，57-30474，58-10075，59-4993，61-35840，62-24074，62-36673，5-11958，7-112437，和7-112438)；其生长需要一种氨基酸例如L-高丝氨酸的突变菌株(日本专利公告号48-28078和56-6499)；抗AEC并且需要诸如L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸和L-缬氨酸等的突变菌株(美国专利3,708,395和3,825,472)；生产L-赖氨酸且抗DL--氨基--己内酰胺、-氨基-月桂内酰胺、天冬氨酸-类似物、磺胺类药物、醌型化合物和N-月桂酰亮氨酸的突变菌株；生产L-赖氨酸且抗oxyaloacetate脱羧酶或呼吸系统酶的抑制剂的突变菌株(日本专利公开号50-53588，50-31093，52-102498，53-9394，53-86089，55-9783，55-9759，56-32995和56-39778，和日本专利公告号53-43591和53-1833)；产生L-赖氨酸且需要肌醇或醋酸的突变菌株(日本专利公开号755-9784和56-8692)；产生L-赖氨酸且显示出对氟丙酮酸或不低于34℃的温度敏感的突变菌株(日本专利公开号55-9783和53-86090)；属于短杆菌属或棒杆菌属显示出抗乙二醇并产生L-赖氨酸的突变菌株(美国专利4,411,997)。
这里的术语“L-赖氨酸生产能力”的意思是指棒状细菌在培养基中培养时能够在培养基中积累相当数量的L-赖氨酸或增加细胞内L-赖氨酸含量的能力。
<2>增加磷酸果糖激酶的活性为了增加在棒状细菌细胞内的磷酸果糖激酶的活性，通过连接磷酸果糖激酶编码基因片段和细胞内有功能的载体，优选多拷贝载体，在一起制备重组DNA并导入具有L-赖氨酸生产能力的棒状细菌改造这种细菌。在转化体细胞内磷酸果糖激酶编码基因拷贝数目增加，从而增加了磷酸果糖激酶的活性。大肠杆菌内，ptkA和pfkB基因编码磷酸果糖激酶。
作为编码磷酸果糖激酶基因，可以使用来自于棒状细菌的也可以使用来自于其它有机体如属于埃希氏菌属的细菌的基因。
来自于大肠杆菌的编码磷酸果糖激酶基因的核苷酸序列已经被阐明(Daldal，F.，Gene，28，337-342(1984)；Daldal，F.，J.Mol.Biol.，168，，285-305(1983)；GenBank/EMBL/DDBJ accession No.K00128).。因此，pfkB基因能够利用根据核苷酸序列制备的引物例如序列表中的SEQ IDNO1和2的引物以及大肠杆菌染色体DNA作为模板通过PCR(聚合酶链式反应，见White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185(1989))来得到。因为来自大肠杆菌的pfkA基因已经得到阐明(Eur.J.Biochem.，149(2)，363-373(1985))，pfkA基因应该能够同样的获得。来自其他微生物例如棒状细菌的磷酸果糖激酶基因应该也能同样的获得。
采用Saito和Miura方法，染色体DNA能够从作为DNA供体的细菌制备(H.Saito和K.Kimura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)；Seibutsu Kogaku Jikkensho，日本生命科学和生物工程学会编辑，97-98，Baifukan，1992)。
作为来自于棒状细菌的编码磷酸果糖激酶的基因(pfk基因)，其部分可以通过以下方法获得选择与从已知的编码磷酸果糖激酶基因例如大肠杆菌的ptkA基因(Eur.J.Biochem.149(2)，363-373(1985))、天蓝色链霉菌的ptk基因(Appl.Environ.Microbiol.63(3)，956-961(1997))的核苷酸序列推导出的氨基酸序列有高同源性的区域，并使用在这个区域氨基酸序列基础上制备的引物进行PCR。引物的例子包括序列号为SEQID NO3和SEQ ID NO4的寡核苷酸。
为了采用如上述方法获得的pfk基因片段测定pfk基因的全长序列，使用了反向PCR方法(Genetics120，621-623(1988))、使用LA-PCR体外克隆试剂盒的方法(Takara Shuzo)等。反向PCR方法在后面描述的举例中被采用。特别是，使用例如SEQ ID NO7和SEQ ID NO8寡核苷酸作为引物，乳发酵短杆菌染色体DNA作为模板实施PCR。采用扩增产物作为模板和序列SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的寡核苷酸实施嵌套PCR(Technique，1，165-170(1989))。如上所述测定的含有pfk基因的大约为1300bp的核苷酸序列如SEQ ID NO11所示。从核苷酸序列预测开放阅读框的翻译获得的氨基酸序列示于SEQ ID NO12。与已知序列的同源比较表明这种pfk基因是一种新的基因。除了上述方法以外，含有基因编码区域的DNA片段也能采用SEQ ID NO11所示的核苷酸序列中非翻译区域的5`和3`的核苷酸序列借助PCR获得。
磷酸果糖激酶编码基因可以是编码具有SEQ ID NO12的氨基酸序列并在一个或几个位置包括一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加或倒位的磷酸果糖激酶编码基因，除非这个编码磷酸果糖激酶的活性受到破坏。这里的术语“几个”的变化可以取决于蛋白质的立体结构和氨基酸残基的种类。这是因为某些氨基酸有他们类似的氨基酸例如异亮氨酸和缬氨酸，这两种氨基酸的差别并不在很大程度上影响蛋白质的立体结构。例如，乳发酵短杆菌的pfk基因编码磷酸果糖激酶可以是有磷酸果糖激酶活性并且相对完整的SEQ ID NO11氨基酸序列有不小于70到80％优选不小于80到90％的同源性的磷酸果糖激酶。这里使用的同源性是一种采用LipmanPearson方法(Science227，1435-1441(1985))或Takashi和Gotoh方法计算的数值。特别是，“几个”可以是2到30，优选2到20，更优选2到10。
编码与上述磷酸果糖激酶完全相同的蛋白质的DNA能够通过修饰一个pfk基因核苷酸序列获得，从而通过例如定点诱变使氨基酸序列在特定位置的一个或几个氨基酸残基含有取代、缺失、插入、添加或倒位。上述这样的修饰DNA也可以通过常规诱变处理得到。诱变处理的例子包括用羟胺等体外处理编码磷酸果糖激酶的DNA，通过紫外辐射或常用诱变处理剂例如N-甲基-N＇-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸对含有磷酸果糖激酶编码基因的微生物如埃希氏菌属细菌进行处理。
上述核苷酸的取代、缺失、插入、添加或倒位包括天然存在的突变(突变体或变体)例如观察到的含有磷酸果糖激酶的微生物菌株或种类之间的差别。
与上述磷酸果糖激酶基本相同的蛋白质的编码DNA能够通过允许有上述在适当细胞内突变的DNA的表达，并且检查表达产品的磷酸果糖激酶活性来得到。和磷酸果糖激酶基本相同的蛋白质编码基因通过从如下物质中分离得到，从具有突变的磷酸果糖激酶编码DNA或含有它们之一的细胞，在严紧条件下可与编码具有磷酸果糖激酶活性的蛋白质、包括序列表中SEQ ID NO12所示核苷酸序列第16-第1153号核苷酸的核苷酸序列的DNA或能够从PCR或类似方法制备的寡核苷酸探针杂交的DNA。这里的术语严紧条件意味一种允许形成特异性杂交形成并且不允许形成非特异性杂交的条件。通过数值明确限定这种条件是困难的。但是，它可以是，例如允许高同源性DNA例如同源性70％或更高的DNA杂交但是不允许比上述限定更低的同源性的DNA杂交的条件，或通常DNA杂交的冲洗条件，60℃，1×SSC和0.1×SSC和0.1×％SDS.。这里使用的同源性是一种采用LipmanPearson方法(Science227，1435-1441(1985))或Takashi和Gotoh方法(J.Biochem92，1173-1177(1984))计算的数值。按照本领域技术人员已知的方法能够进行设计这种探针。
如上所述的条件下杂交的基因也包括在序列中有终止密码子并且编码由于活性中心突变而不再具有其活性的酶的基因。但是，这样的基因能够通过连接它们到一个可商购的活性表达载体上并测量磷酸果糖激酶的活性的方法消除。磷酸果糖激酶活性能够采用例如Bloxham，D.P.和Lardy，H.A.，The Enzymes(3rd ed.)，8，239-278(1973)描述的方法进行测量。
优选如上所述获得的磷酸果糖激酶编码基因和一个在大肠杆菌和/或棒状细菌内能自主复制的载体DNA连接在一起形成重组DNA，并且这个重组DNA引入大肠杆菌细胞，随后的程序能够很容易进行。大肠杆菌内自主复制载体优选质粒载体，优选在宿主细胞内自主复制的载体。这些例子包括pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG399，pHSG398，RSF1010等等。
在棒状细菌细胞内可自主复制的载体可以是pAM330(日本专利公开号58-67699)，pHM1519(日本专利公开号58-77895)等。而且，在棒状细菌内有能力制造自主复制质粒的DNA片段被从这些载体中提取出来并且插入上述大肠杆菌的载体中，它们能够被用于作为在大肠杆菌和棒状细菌中自主复制的穿梭载体。穿梭载体的例子包括如下。携带相应载体的微生物的国际保藏机构保藏号示于如下括号。
pAJ655大肠杆菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒杆菌5R8201(ATCC39135)pAJ1844大肠杆菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒杆菌SR8202(ATCC39136)pAJ611大肠杆菌AJ11884(FERM BP-138)pAJ3148谷氨酸棒杆菌5R8203(ATCC39137)pAJ44O枯草杆菌AJ119O1(FERM BP-140)pHC4大肠杆菌AJ12617(FERM BP-3532)为了将磷酸果糖激酶基因和一个载体连接制备重组DNA，这个载体被相应于含有磷酸果糖激酶基因的DNA片段的末端的限制酶消化。通常采用连接酶进行连接，例如T4 DNA连接酶。
为了将如上所述制备的重组DNA导入棒状细菌，任何已知的转化方法都能使用。例如，用氯化钙处理受体细胞增加DNA渗透性的方法，这种方法在有关大肠杆菌K-12的报告中有报道(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))和从导入DNA在成长期的细胞中制备感受态细胞的方法，这种方法在有关枯草杆菌的报告中有报道(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E.，Gene，1，153(1977))，这两种方法都可以使用。或者，采用导入重组DNA后容易获得重组DNA的原生质体或圆球体，制备DNA受体细胞的方法(Chang，S.和Choen1S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，Nature，274，398 (1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Nati.Acad.Sci.USA，75 1929(1978))。而且，棒状细菌的转化也可以按照电脉冲的方法进行(日本专利公开号2-207791)。
提高磷酸果糖激酶活性能够通过允许宿主染色体DNA上存在多拷贝磷酸果糖激酶编码基因来取得。为了将多个磷酸果糖激酶编码基因的拷贝导入属于棒状细菌的微生物染色体DNA，采用在染色体DNA的多拷贝存在的序列作为目标靶进行同源重组。作为以多拷贝存在于染色体DNA的序列，可以使用重复DNA、在转座子末端的倒转重复。也可以如日本公开专利NO.2-109985所公开的，将磷酸果糖激酶编码基因整合进转座子，并且允许它被转移以向染色体DNA导入多个拷贝。借助任一种方法，可以在转化菌株中增加磷酸果糖激酶编码基因的拷贝数，并导致磷酸果糖激酶活性增加。
除了借助于前述基因扩增以外，用较强的表达调控序列取代染色体DNA或质粒上的表达调控序列如磷酸果糖激酶编码基因的启动子也能增加磷酸果糖激酶活性。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR启动子和PL启动子。用这些启动子的取代增加磷酸果糖激酶编码基因的表达，从而增加磷酸果糖激酶活性。
本发明的棒状细菌中，除了磷酸果糖激酶活性，L-赖氨酸生物合成途径、糖酵解途径等的另一种酶的活性可以通过导入或这种基因的扩增被增大。作为在L-赖氨酸生产中可以使用的基因的例子，已知有L-赖氨酸或L-苏氨酸(国际公开号WO94/25605)的协同反馈抑制基本脱敏的天门冬氨酸激酶的α-亚单位或β-亚单位的编码基因，来自于棒状细菌的野生型的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(日本专利公开号60-87788)，来自于棒状细菌的野生型的二氢2，6-吡啶二羧酸合酶的编码基因(日本专利公告号6-55149)等。
而且，催化产生一种非L-赖氨酸的化合物和从L-赖氨酸生物合成途径分支的反应的酶的活性可以降低或缺失。作为催化产生一种非L-赖氨酸的化合物和从L-赖氨酸生物合成途径分支的反应的酶，可以提及高丝氨酸脱氢酶(见WO95/23864)。
在本说明书中的“(酶)活性的增加”的意思是指该菌株的细胞内酶的活性比野生菌株的高，基因重组或类似方法获得的菌株的酶的细胞内活性高于未修饰的菌株的。而且，“(酶)活性的降低”的意思是指该菌株的细胞内酶的活性比野生菌株的要低，通过基因重组或类似方法获得菌株的细胞内酶的活性比未修饰的菌株的酶要低。
<3>L-赖氨酸的产生通过在适宜的培养基中培养具有L-赖氨酸的生产能力、细胞内的磷酸果糖激酶的活性增加的棒状细菌，在培养基中积累L-赖氨酸。
用于通过使用本发明所述的微生物生产L-赖氨酸的培养基，可以是包含碳源，氮源，无机离子和其他可选的有机痕量营养素的普通培养基。作为碳源的有碳水化合物如葡萄糖，乳糖，半乳糖，果糖，蔗糖，糖蜜和淀粉水解产物；如乙醇和肌醇的醇类，有机酸如乙酸，延胡索酸，柠檬酸，琥珀酸。
作为氮源，可以使用无机铵盐如硫酸铵，硝酸铵，氯化铵，磷酸铵，醋酸铵；有机氮源如氨水，蛋白胨，肉汁，酵母浸膏，玉米浆和大豆水解物；氨气；氨水。
作为无机离子，磷酸钾，硫酸镁，铁离子，锰离子等可被少量的加入。作为有机的痕量营养素，最好包含所需要的适宜量的物质如维生素B1或酵母浸膏等。
培养优选振荡培养，通气搅拌或类似的好氧条件下培养16-72小时。培养温度通常控制在30℃-45℃，pH通常控制在5-9之间。用于pH调节的有无机或有机酸性或碱性的物质，或氨气等。
L-赖氨酸可以通过普通的离子交换树脂的方法，沉淀方法和其他已知方法从培养基中收集得到。
实施例本发明将引用下面的相关实施例作更具体的说明。
实施例1将大肠杆菌pfkB基因导入产赖氨酸的棒状细菌的菌株，生产L-赖氨酸。
1>、克隆大肠杆菌JM109的pfkB基因大肠杆菌的核苷酸序列已经被完全公开(Daldal，F.，Gene，28，337-342(1984)；Daldal，F.，J.Mol.Biol.，168，，285-305(1983)；GenBank/EMBL/DDBJ accession No.K00128)。引物根据序列表中SEQID Nos1和2的核苷酸序列合成，使用大肠杆菌的染色体DNA作为模板作PCR扩增磷酸果糖激酶基因。
合成的引物中，SEQ ID NO1相应于Daldal，F.，Gene，28，337-342(1984)所描述的pfkB基因序列中第1个到第24个碱基的序列，SEQ IDNO2相应于第1268到第1245碱基的序列。
制备大肠杆菌染色体DNA根据普通的方法(Seibutsu KogakuJikkensho，日本生命科学和生物工程学会ed.，97-98，Baifukan，1992)进行。而且，对于PCR反应，使用在PCR Hou Saizensen(Takeo sekiya etal.ed.，Kyoritsu Shuppan，1989)的第85页记载的标准条件。
按照普通方法纯化PCR产物，然后通过连接试剂盒(Takara Shuzo)与质粒pHC4(见日本专利公开号5-7491)连接，再转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)感受态细胞，涂布在含有5ug/ml氯霉素LB-培养基(10g/L细菌培养用胰蛋白胨，5g/L细菌用酵母浸膏，5g/L Nad，15g/L琼脂，pH7.2)上并培养过夜。白色的菌落被挑出，并进行单菌落分离以获得转化体。从已获得的转化体中提取质粒pHC4pfk，其中pfkB基因与载体连接。
携带pHC4的大肠杆菌被命名为AJ12617，并且在1991年4月24日被保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(postalcode 305-8566，1-3 Higashi 1-chome，Tsukuba-shi1 Ibaraki-ken，Japan)，保藏号为FERM P-12215，在1991年8月26日按照布达佩斯条约被转为国际保藏，保藏号为FERM BP-3532。
为了确认克隆的DNA片段编码的蛋白质具有磷酸果糖激酶活性，菌株JM109和含有pHC4pfk的菌株的磷酸果糖激酶活性按照Bloxham，D.P.和Lardy，H.A.，The Enzymes(3rd ed.)，8，239-278(1973)所描述的方法测定。结果表明，含pHC4pfk的菌株JM109比不含pHC4pfk的菌株JM109的磷酸果糖激酶活性高出15倍，由此确认pfkB基因被表达。
<2>将pHC4pfk导入产L-赖氨酸的棒状细菌，生产L-赖氨酸乳发酵短杆菌AJ11082通过电脉冲的方法用质粒pHC4pfk转化(日本专利公开号2-207791)，以获得转化体。
应用获得的转化体AJ11082/pHc4pfk，如下进行L-赖氨酸的生产培养。在含有5ug/ml氯霉素的CM2B培养基上培养获得的菌株AJ11082/pHC4pfk的细胞，接种于含有以下成分并包含5ug/ml氯霉素的产L-赖氨酸的培养基上，在31.5℃振荡培养直到培养基中的糖耗尽为止。作为对照，棒杆菌属菌株AJ11082用已获得的在棒杆菌属细菌中可自主复制的质粒pH4通过电脉冲转化，并用上述相似方法培养。
菌株乳发酵短杆菌AJ11082于1981年1月31日被保藏在农业研究机构保藏中心(1815 N.University Street，Peoria，Illinois 61604U.S.A.)，保藏号为NRRL B-11470。
「产L-赖氨酸的培养基」除碳酸钙以外的下列成分(每升)被溶解并且pH用KOH调节到8.0。培养基在115℃15分钟灭菌，碳酸钙(50g)单独干热灭菌，再加入到已灭菌的培养基中。
葡萄糖 100g(NH4)2SO455gKH2PO41gMgSO4·7H2O 1g生物素 500ug维生素B12000ugFeSO4·7H2O 0.01gMnSO4·7H2O 0.01g烟酰胺 5mg蛋白质水解物(Mamenou) 30ml碳酸钙 50g
培养完成后，在培养基中L-赖氨酸的积累量通过Biotec分析器AS-210(Asahi Kasei Kogyo)被确定。其结果在表1中显示。
表1
实施例2从乳发酵短杆菌中克隆pffk基因<1>菌株乳发酵短杆菌ATCC13869的pfk基因的部分片段的获得天蓝色链霉菌的pfk基因(Appi.Environ.Microbiol.63(3)，956-961(1997))和大肠杆菌的pfkA基因(Eur.J.Biochem.149(2)，363-373(1985))编码的磷酸果糖激酶的氨基酸序列之间的一个区域具有高同源性，作为已知的pfk基因被选择。由该区域推导核苷酸序列以合成寡核苷酸的序列SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。
乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA通过使用细菌染色体组DNA纯化试剂盒(Advanced Genetic Technologies Corp.)来制备。通过在0.5ug染色体DNA，20pmol寡核苷酸，4ul dNTP混合物(各2.5mM)，5ul ExTaq缓冲液(Takara Shuzo)中添加已灭菌的水来制备总体积为50ul的PCR混合物。
使用PCR混合物，在热循环仪TP240(Takara Shuzo)中于94℃，30秒变性，37到60℃，15秒退火；72℃，45秒延伸的条件下作30次循环。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳显示反应混合物中含有当退火温度是45℃时约460bp的带。
当退火温度是45℃时包括在反应混合物中的反应产物，通过Original TA克隆试剂盒与pCR2.1(Invitrogen.)连接。大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)的感受态细胞用连接产物转化，涂布到含有10ug/mlIPTG(异丙基--D-硫代半乳糖吡喃糖苷)，40ug/ml X-Gal(5-溴代-4-氯代-3-吲哚基--D-硫代半乳糖吡喃糖苷)，25ug/ml的卡那霉素的LB-培养基(10g/L细菌用胰蛋白胨，5g/L细菌用的酵母浸膏，5g/L NaCl，15g/L琼脂，pH7.2)，过夜培养。白色的菌落被挑出，并进行单菌落分离以获得转化体。
从转化体用碱性方法(Seibutsu Kogaku Jikkensho，日本生命科学和生物工程学会ed.，p.105，Baifukan，1992)来制备质粒。在所插入片段两端的核苷酸序列通过Sanger′s方法使用核苷酸序列SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的寡核苷酸来确定(J.Mol.Biol.，143，161(1980))。特别是，Bigdye终止子测序试剂盒(Applied Biosystems Inc.)用于测序，通过Genetic Analyzer ABI310(Applied Biosystems Inc.)来分析序列。确定的核苷酸序列翻译为氨基酸序列。天蓝色链霉菌和大肠杆菌的pfk基因推导的氨基酸序列比较显示出高的同源性。因此，确定pCR2.1中的克隆片段是乳发酵短杆菌的pfk基因。
<2>测定乳发酵短杆菌的pfk基因的全核苷酸序列上述<1>制备的质粒中含有的片段是所述pfk基因的部分片段，pfk的全长基因的核苷酸序列有必要被确定。作为确定已知区域旁侧的未知核苷酸序列的方法，已知有反向PCR的方法(Genetics120，621-623(1988)，使用LA-PCR的体外克隆试剂盒的方法等。在本实例中，将按照反向PCR方法中确定未知核苷酸序列。
以上述<1>中所述的核苷酸序列的确定为基础，SEQ ID NO7，SEQID NO8，SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示的寡核苷酸被合成。乳发酵短杆菌的染色体DNA被EcoRI，BamHI，KpnI，HindIII，PstI，SphI，SacI和SalI完全消化，消化产物通过连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)的分子内连接而环化。向0.5ug环化染色体DNA，10pmol的SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示的寡核苷酸，4ul dNTP混合物(各2.5mM)，5ul10X ExTaq Buffer(Takara Shuzo)和1U的ExTaq(Takara Shuzo)的混合物中加入无菌水制备总体积为50ul的PCR混合物。使用该PCR混合物，在热循环仪TP240(Takara Shuzo)中于94℃，30秒变性；55℃，15秒退火；72℃，延伸的条件下作30次循环。
PCR产物通过琼脂糖凝胶分析，但如果使用任何限制性酶则不能清楚的观察到扩增产物。因此，进一步进行嵌套PCR(Technique，1，165-170(1989)。向无菌水稀释1000倍的1ul PCR反应混合物，10pmol的SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的寡核苷酸，4ul dNTP混合物(各2.5mM)，5ul 10X ExTaq Buffer(Takara Shuzo)和1U的ExTaq(TakaraShuzo)的混合物中加入无菌水制备总体积50微升的PCR混合物。使用该PCR混合物，在热循环仪TP240(Takara Shuzo)中于94℃，30秒变性；55℃，15秒退火；72℃，延伸的条件下作30次循环。
PCR产物被琼脂糖凝胶分析。结果，当以PstI消化并以分子内连接产物作为模板获得的产物在大约2000bp观察到条带。PCR产物用Suprec ver.2(Takara Shuzo)纯化，2000bp的PCR产物中包含的pfk基因的核苷酸序列用SEQ ID NO9和SEQ ID NO10.所示的寡核苷酸采用<1>中所述的类似方法确定。
在确定的核苷酸序列中包含pfk基因的约1300bp核苷酸示于SEQID NO13。由核苷酸序列推测的开放阅读框翻译的氨基酸序列示于SEQ ID NO12。含有SEQ ID NO12所示的氨基酸序列的蛋白质是乳发酵短杆菌的磷酸果糖激酶。因为存在于蛋白质N-末端的甲硫氨酸残基来源于起始密码ATG，该残基通常与蛋白质的重要功能无关。而且，该残基经常在翻译后被肽酶作用除去是公知的。在上述蛋白质中，可以除去甲硫氨酸。
对上述每一个核苷酸序列和氨基酸序列，进行了与已知序列的同源性比较。应用GenBank和SWISS-PROT数据库。结果表明，序列SEQID NO11所示的DNA是编码和已公开的编码大肠杆菌的pfkA的PFK具有同源性的蛋白质的基因，在棒状细菌中是新的。
工业实用性根据本发明，棒状细菌的L-赖氨酸的产率可以被提高，因此提供一种更有效生产L-赖氨酸的方法。而且，本发明乳发酵短杆菌的磷酸果糖激酶基因可以被合适地用来繁育产L-赖氨酸的棒状细菌。
序列表<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>生产L-赖氨酸的方法<130>B-593MSOP977<150>JP 11-311111<151>1999-11-01<150>JP 11-168377<151>1999-06-15<160>12<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明扩增大肠杆菌pfkB基因的引物<400>1aagcttcatt tatcaagagt ccgt 24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明扩增大肠杆菌pfkB基因的引物<400>2tgattccccc aatgctgggg gttt 24<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明pfk克隆引物1<220><221>misc feature<222>(3)<223>n＝a或g或c或t<400>3acnathgaya aygayrt 17<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明pfk克隆引物2<220><221>misc feature<222>(3，6，9，15)<223>n＝a或g或c或t<400>4gtnccnccnc kytgnayrtg 20<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明序列引物M13-20<400>5gtaaaacgac ggccag 16<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明序列引物M13RV<400>6caggaaacag ctatgac 17<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明反向PCR引物1A<400>7agcaatccaa cccacgtggc 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明反向PCR引物1B<400>8acattgacca gttcggtcac 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明巢式引物A<400>9ggcccatgac ctccacgatc 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列说明巢式引物B<400>10gaccttcacg ggaattggac 20<210>11<211>1357<212>DNA<213>乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)<220><221>CDS<222>(116)..(1153)<400>11ctgcagctct ggcgattaaa taaggtggtc agagacaatt tttcggcctg tcaacccctg 60tgattctctt atttttgggt gattgttccg gcgcgggtgt tgtgatgggt ttaat atg 118Met1gaa gac atg cga att gct act ctc acg tca ggc ggc gac tgc ccc gga 166Glu Asp Met Arg Ile Ala Thr Leu Thr Ser Gly Gly Asp Cys Pro Gly5 10 15cta aat gcc gtc atc cga gga atc gtc cgc aca gcc agc aat gaa ttt 214Leu Asn Ala Val Ile Arg Gly Ile Val Arg Thr Ala Ser Asn Glu Phe20 25 30ggc tcc acc gtc gtt ggt tat caa gac ggt tgg gaa gga ctg tta gcc 262Gly Ser Thr Val Val Gly Tyr Gln Asp Gly Trp Glu Gly Leu Leu Ala35 40 45gat cgt cgc gta cag ctg tat gac gat gaa gat att gac cga atc ctc 310Asp Arg Arg Val Gln Leu Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Asp Arg Ile Leu50 55 60 65ctt cga ggc ggc acc att ttg ggc act 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权利要求
1.一种棒状细菌，其细胞内的6-磷酸果糖激酶的活性增加，而且有产生L-赖氨酸的能力。
2.权利要求
1的棒状细菌，其中通过增加该细菌细胞内6-磷酸果糖激酶编码基因的拷贝数，其细胞内6-磷酸果糖激酶的活性得以增加。
3.权利要求
2的棒状细菌，其中6-磷酸果糖激酶编码基因来自棒状细菌。
4.生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤在培养基中培养权利要求
1到3任一项的棒状细菌以在培养基中生产和积累L-赖氨酸，并从培养基中收集L-赖氨酸。
5.编码以下(A)或(B)限定的蛋白质的DNA(A)具有SEQ ID NO12氨基酸序列的蛋白质，或(B)具有SEQ ID NO12氨基酸序列并且其中包括一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、增加或倒位的蛋白质，并且具有6-磷酸果糖激酶活性。
6.根据权利要求
5的DNA，其为以下(a)或(b)限定的DNA(a)具有包含SEQ ID NO11从第116到第1153号核苷酸的核苷酸序列的DNA；或(b)在严紧条件下，可与具有包含SEQ ID NO11从第116到第1153号核苷酸的核苷酸序列的探针或其部分杂交并且编码具有6-磷酸果糖激酶活性的蛋白质的DNA。
专利摘要
细胞内6－磷酸果糖激酶活性提高且能够产生L－赖氨酸的棒状细菌;生产L－赖氨酸的方法,包括在培养基中培养棒状细菌以产生和积累L－赖氨酸,并收集L－赖氨酸;以及可以用来增加6－磷酸果糖激酶活性的DNA。
文档编号C12P13/08GKCN1370228SQ00811609
公开日2002年9月18日 申请日期2000年6月8日
发明者杉本雅一, 中村纯, 泉井裕, 木村英一郎, 伊藤久生, 中松亘, 仓桥修 申请人:味之素株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan