治疗感染性疾病和免疫系统疾病的化合物及其使用方法

专利名称：:治疗感染性疾病和免疫系统疾病的化合物及其使用方法
技术领域：
：本发明一般涉及对感染性疾病的检测、治疗和预防。具体而言，本发明涉及含有分离自母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)的免疫原性表位的化合物，并涉及这些化合物在抗感染性疾病的疫苗接种或免疫治疗方面以及在某些免疫疾病和癌症治疗方面的用途，所述感染性疾病包括分枝杆菌感染，诸如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染或鸟分枝杆菌(Mycobacteriumavium)感染。结核病是一种由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染引起的慢性感染性疾病。结核病在发展中国家是一种主要疾病，并且在世界发达地区问题也愈发严重，每年约800万新增病例，300万人死亡。尽管结核分枝杆菌感染在相当长的一段时间内可能无症状，但该疾病最常表现为慢性肺炎，导致发热和呼吸系统症状。如果不治疗，可导致病情显著加重甚至死亡。尽管一般延长抗生素治疗可控制结核病，但这样的治疗不足以预防该病的蔓延。受感染的个体可能无症状，但在一定时间内会接触性传染。另外，尽管对治疗方案的依从性很关键，但患者行为难以监控。某些患者没有完成疗程，这可能导致治疗无效并产生抗药性分枝杆菌。抑制结核病扩散需要有效的疫苗接种和对疾病的正确的早期诊断。目前，活菌疫苗接种是最有效的诱导保护性免疫的方法。为此最常使用的分枝杆菌是卡介苗(BCG)，一种牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)无毒株。然而，BCG的安全性和有效性一直有争论，而在某些国家如美国，不接种一般人群。通常使用皮试诊断结核分枝杆菌感染，皮试就是皮内接触结核菌素PPD(纯化蛋白衍生物)。抗原特异性T细胞应答在注射后48-72小时在注射部位产生可检测的硬结，由此指示接触分枝杆菌抗原。然而，皮试具有敏感性和特异性的问题，并且不能区分开BCG接种个体和感染个体。母牛分枝杆菌是一种已用于免疫治疗结核病以及麻风病的少为人知的分枝杆菌，对人是非病原体。然而，与BCG相比，关于母牛分枝杆菌有效性的信息较少，并且它还没有广泛用于接种一般人群。牛分枝杆菌BCG和母牛分枝杆菌被认为含有接触结核分枝杆菌感染的个体免疫系统识别的抗原性化合物。若干专利和其它出版物公开了通过给予分枝杆菌(包括母牛分枝杆菌)或某些分枝杆菌成分治疗各种病症。国际专利公开号WO91/02542公开了对其中患者异常释放高水平IL-6和/或TNF或患者的IgG显示异常高比例的非半乳糖IgG的慢性炎症性疾病的治疗。在该公开专利中提及的疾病当中有牛皮癣、类风湿性关节炎、分枝杆菌疾病、节段性回肠炎、原发性胆汁性肝硬化、肉样瘤病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化病、Guillain-Barre综合症、原发性糖尿病和某些方面的移植排斥反应。治疗药物优选包括单剂量注射给予高压灭菌的母牛分枝杆菌。美国专利4,716,038公开了对各种类型的自身免疫病(包括关节炎)的诊断、针对性疫苗接种和通过给予分枝杆菌包括母牛分枝杆菌进行治疗。美国专利4,724,144公开了用于治疗分枝杆菌疾病尤其是结核病和麻风病并作为化疗辅助剂的免疫治疗剂，它包含得自母牛分枝杆菌的抗原性物质。国际专利公开号WO91/01751公开了使用得自母牛分枝杆菌的抗原性物质和/或免疫调节物质作为免疫预防剂，以延迟和/或预防AIDS发生。国际专利公开号WO94/06466公开了使用得自母牛分枝杆菌的抗原性物质和/或免疫调节物质治疗患或未患AIDS以及相关性结核病的HIV感染。传统疫苗包括减毒或灭活形式的致病生物(或其组分)。作为传统疫苗的替代方法，已开发了针对多种疾病如AIDS、流感、癌症和疟疾的DNA疫苗。针对众多这样的疾病的DNA疫苗的临床实验正在进行中。典型的DNA疫苗包括克隆入无活性质粒载体中的编码抗原的DNA。由所述疫苗DNA编码抗原的表达通常处于强启动子控制之下，如人β-肌动蛋白启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)启动子或CMV启动子(RamsayAJ等，ImmunologyandCellBiology75360-363，1997)。Tang等人获得了DNA疫苗能够诱导需要的免疫应答的第一个实验证据(TangD-C等，Nature356152-154，1992)。在这些实验中，用包含人生长激素编码基因的质粒接种小鼠产生特异性初次抗体应答。已经在动物模型中评价了针对两种含结核分枝杆菌基因的DNA疫苗的免疫应答。第一种疫苗含有GroEL应激蛋白(65kDa蛋白；TasconRE等，NatureMed.2888-892，1996)编码基因。用此DNA疫苗注射小鼠获得的保护水平与接受传统BCG疫苗的小鼠相等。第二种针对结核分枝杆菌的DNA疫苗包含编码抗原85复合物的抗原的DNA，获得了与Tang等人研究的相似结果(HuygenK等，NatureMed.2893-898，1996)。美国专利5,736,524公开了通过给予一种多核苷酸结核疫苗免疫接种驯养哺乳动物或家畜，以抵抗结核分枝杆菌或牛分枝杆菌感染，所述疫苗包含有效连接至转录调节元件的结核分枝杆菌抗原85基因。最近报道了第一个人DNA疫苗实验(WangR等，Science282476-80，1998)。在该实验中，将疟疾的致病因子恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)抗原注射入健康自愿者。根据出现细胞毒性T(CD8+)淋巴细胞(CTL)证实激发了需要的免疫应答，提示免疫系统应当能够清除感染患者体内的寄生虫。McGregor等进行的实验测定了抗HIV-1感染的人DNA疫苗的安全性和免疫原性(J.Infect.Dis.17892-100，1998)。其它DNA疫苗实验的实验数据也提示，在注射DNA疫苗后产生MHCI类限制性CD8+CTL和MHCII类限制性CD4+辅助T细胞抗体(Ramsay，AJ等，ImmunologyandCellBiology75360-363，1997)。DNA疫苗显著优于包含灭活或减毒生物的多种传统疫苗。DNA疫苗诱导长效免疫应答，并因此可能只需要一次接种。可将编码多种抗原的DNA加入到单一质粒中，由此提供抗多种疾病的保护。生产DNA疫苗的技术相对简单，相同的技术可用于生产所有的疫苗，使得生产成本更便宜。将有效的传统疫苗传递至患者依赖于保持从生产商至诊所的完整“冷传送链”。生产的溶液或干燥型DNA疫苗对储存条件不敏感。最近开发了构建和提供DNA疫苗的替代途径。在其中一种称为体细胞转基因免疫(STI)的技术中，将携带免疫球蛋白重链基因、处于组织特异性调节元件控制下的质粒DNA直接接种入小鼠脾脏，随后在B细胞表面表达所述抗原(XiongS等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA946352-6357，1997)。这些B细胞产生针对所表达抗原的抗体，引起免疫应答。后来的研究显示，STI诱导的持久性免疫记忆可达2年(GerloniM等，Vaccine(2-3)293-297，1998)。表达文库免疫(ELI)是另一种使用DNA疫苗的技术(BarryMA等，Nature377632-635，1995)。在该技术中，将完整病原体基因组的片段克隆入载体中并用作疫苗。通过筛选和再筛选克隆库，直至可鉴定出单个克隆，来选择保护性抗原，尤其是诱导CTL的保护性抗原。然后可将鉴定的多核苷酸或多肽掺入到已批准使用的传递系统中。最近公开了EpimmuneInc.(SanDiego，CA)的科学家在开发用于治疗和预防HIV感染的表位型疫苗方面的进展(IshiokaGY等，JournalofImmunology1623915-3925，1999)。本领域仍需要有效预防和治疗感染性疾病(例如人和驯养哺乳动物或家畜的结核病和其它分枝杆菌感染)以及有效治疗某些免疫系统相关疾病的化合物和方法。发明简述简而言之，本发明提供预防和治疗感染性疾病(如分枝杆菌感染)以及治疗免疫疾病和癌症的化合物和方法。第一方面，本发明提供得自母牛分枝杆菌基因组的分离多核苷酸。这些多核苷酸编码根据其多种免疫测定结果阐明的免疫原性特性选择的多肽表位。在具体的实施方案中，本发明多核苷酸包含选自以下的序列(a)SEQIDNO8-21中提供的序列；(b)按照计算机算法BLASTN测定，与SEQIDNO8-21的序列具有至少50％、75％或90％相同残基的序列；和(c)序列(a)和(b)的互补物。第二方面，本发明提供含有母牛分枝杆菌抗原的免疫原性表位的分离多肽。在具体的实施方案中，本发明多肽包含选自以下的序列(a)SEQIDNO61-77中提供的序列；和(b)按照计算机算法FASTX测定，与SEQIDNO61-77的序列具有至少50％、75％或90％相同残基的序列。还提供含有至少一种本发明多核苷酸的DNA构建物，以及用这样的DNA构建物转化或转染的宿主细胞。另一方面，本发明提供包含至少一种本发明多肽的融合蛋白。关于其它方面，本发明提供包含至少一种本发明多肽、多核苷酸、融合蛋白或DNA构建物以及一种生理学上可接受的载体的组合物。本发明还提供包含至少一种上述多肽、多核苷酸、融合蛋白或DNA构建物以及一种免疫刺激物的组合物。再一方面，提供增强患者免疫应答的方法，包括给予患者有效量的一种或多种上述组合物。在一个实施方案中，所述免疫应答为Th1应答。本发明的又一方面，提供治疗患者疾病的方法，包括给予患者本发明的组合物。在某些实施方案中，所述疾病选自免疫疾病、感染性疾病和癌症。本发明的这些方面和其它方面在参考以下的详述时会变得更加清晰。如同每个参考文献都单独结合到本文中一样，本文公开的所有参考文献通过引用整体结合到本文中。图2A-D显示用rME/A(图2A)、rME/B(图2B)或rME/D(图2C)皮下免疫BALB/cByJ小鼠时其淋巴结细胞的增殖反应。对照小鼠用PBS免疫(图2D)。图3A-D显示用重组多表位构建物rME/A(图3A)、rME/B(图3B)或rME/D(图3C)皮下免疫BALB/cByJ小鼠时其淋巴结细胞的IFN-γ分泌。对照小鼠用PBS免疫(图3D)。图4A显示用rME/A、rME/D或ME/DDNA由三种不同免疫途径免疫BALB/cByJ小鼠时其淋巴结细胞的增殖反应。图4B显示用PBS免疫的对照小鼠的淋巴结细胞的增殖反应。图5A显示用rME/A、rME/D或ME/DDNA由三种不同免疫途径免疫BALB/cByJ小鼠时其淋巴结细胞分泌IFN-γ的水平。图5B显示用PBS免疫的对照小鼠分泌IFN-γ的水平。图6A显示用rME/A、rME/D或ME/DDNA由三种不同免疫途径免疫BALB/cByJ小鼠时，各个表位对小鼠淋巴结细胞增殖反应的影响。图6B显示用PBS免疫的对照小鼠的淋巴结细胞的增殖反应。图7A显示用rME/A、rME/D或ME/DDNA由三种不同免疫途径免疫BALB/cByJ小鼠时，各个表位对小鼠淋巴结细胞分泌IFN-γ水平的影响。图7B显示用PBS免疫的对照小鼠分泌IFN-γ的水平。图8A和B显示用与rME/A和rME/D体外反应的ME/DDNA免疫小鼠时其血清中抗-ME抗体的滴度和亚型。图8A显示IgG1抗体的滴度，而图8B显示IgG2a抗体的滴度。图9A-C显示了用重组单一表位(图9B)或rME/D(图9C)免疫BALB/cByJ小鼠时其记忆脾细胞的IFN-γ分泌。图9A显示用对照刺激后脾细胞的IFN-γ分泌。图10A和B显示了用rME/A、rME/B或rME/D体外刺激后人PBMC的IFN-γ分泌(图10A)和增殖反应(图10B)。图11A和B显示了用八种重组单一表位体外刺激后人PBMC的IFN-γ分泌(图11A)和增殖反应(图11B)。发明详述如上所述，本发明一般涉及预防和治疗疾病(包括感染性疾病和某些免疫疾病以及癌症)的组合物和方法。这样的疾病的实例包括但不限于分枝杆菌感染，包括结核分枝杆菌感染和鸟分枝杆菌感染；以及刺激Th1免疫应答有益的疾病，包括(但不限于)牛皮癣和过敏性鼻炎。某些病原体(如结核分枝杆菌)以及某些癌症可被称之为细胞介导免疫的CD4+T细胞控制的免疫攻击有效遏制。其它病原体如脊髓灰质炎病毒还需要B细胞产生的抗体来遏制。免疫攻击的这些不同类型(T细胞或B细胞)由不同的CD4+T细胞亚群控制，通常称之为Th1细胞和Th2细胞。这两种类型的Th细胞亚群已经在鼠类模型中被充分地特征鉴定过，并由它们在激活时释放的细胞因子定义。Th1亚群分泌IL-2、IFN-γ和肿瘤坏死因子，并介导巨噬细胞活化和延迟型超敏反应。Th2亚群释放刺激B细胞活化的IL-4、IL-5、IL-6和IL-10。Th1亚群和Th2亚群相互抑制，使得IL-4抑制Th1型应答，而IFN-γ抑制Th2型应答。在人类发现了相似的Th1亚群和Th2亚群，它们释放的细胞因子与在鼠类模型观察到的相同。Th1型免疫应答增强是许多疾病病况逆转的决定因素，所述疾病包括呼吸系统疾病，诸如结核病、肉样瘤病、哮喘、过敏性鼻炎和肺癌。一方面，本发明的组合物包括含有至少一种母牛分枝杆菌抗原的免疫原性表位的多肽或其变异体。在具体的实施方案中，本发明多肽包含SEQIDNO61-77所提供的序列。这样的多肽刺激接触了结核分枝杆菌的个体的T细胞增殖和/或分泌γ干扰素。本文使用的术语“多肽”包括任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白(即抗原)，其中所述氨基酸残基通过共价肽键连接。因此，含有以上一种抗原的免疫原性表位的多肽可完全由所述免疫原性表位组成，或者可包含另外的序列。所述另外的序列可得自天然母牛分枝杆菌抗原或者可以是异源性序列，而且所述序列可以(但不需要)是免疫原性序列。本文使用的“免疫原性”是指激发患者(如人)或生物样品免疫应答的能力。具体而言，免疫原性表位是能够刺激生物样品细胞增殖、产生IL-12或产生γ干扰素的多肽部分，其中所述生物样品含有一种或多种以下细胞得自分枝杆菌免疫个体的T细胞、NK细胞、B细胞和巨噬细胞。一般来说，使用以下实施例1详述的测定技术检测，免疫原性表位刺激分枝杆菌免疫个体PBMC增殖的水平比在对照PBMC中观察到的至少高2倍。或者，或还同时，根据实施例1详述的ELISA测定OD增加至少2倍的检测结果，免疫原性表位刺激分枝杆菌免疫个体的PBMC产生γ干扰素的水平比在对照细胞观察到的至少高2倍。分枝杆菌免疫个体被认为是可利用已建立的针对结核分枝杆菌、环境腐生物或BCG的有效T细胞应答抵抗分枝杆菌感染发生的个体。这样的个体可根据对结核蛋白(PPD)的强阳性(即大于约10mm直径硬结)皮内皮试反应以及没有结核感染的任何症状来鉴定。含一种或多种母牛分枝杆菌抗原的至少一种免疫原性表位的多肽一般可用于在患者中诱导抗结核病的保护性免疫和/或在患者中刺激免疫应答。另一方面，本发明的组合物包含编码母牛分枝杆菌抗原的免疫原性表位的分离多核苷酸。在具体的实施方案中，本发明多核苷酸包含SEQIDNO5-21的序列。还提供本发明分离多核苷酸的互补物、反向互补物和反向序列以及它们的变异体。本发明还包括与所公开的序列不同但由于遗传密码简并性而与本文公开的多核苷酸序列编码相同多肽的多核苷酸序列。本文使用的术语“多核苷酸”是指单链或双链的脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基的聚合物，包括有义链和反义链的DNA分子和相应的RNA分子(包括HnRNA和mRNA分子)，并且包括cDNA、基因组DNA和重组DNA以及全部或部分合成的多核苷酸。HnRNA分子包含内含子并以通常的一对一方式和DNA分子相对应。mRNA分子对应于HnRNA分子和/或已去除所述内含子的DNA分子。多核苷酸可由完整基因组成，或由其任一部分组成。有效的反义多核苷酸可以包含对应多核苷酸的片段，因此“多核苷酸”的定义包括所有这些有效反义片段。反义多核苷酸以及涉及反义多核苷酸的技术是本领域众所周知的，描述于例如Robinson-Benion等，“反义技术”，MethodsinEnzymol.254363-375，1995；和Kawasaki等，Artific.Organs20836-848，1996。以下的实例最清晰地阐述了本文使用的术语“互补物”、“反向互补物”和“反向序列”的定义。对于序列5′AGGACC3′，互补物、反向互补物和反向序列如下互补物3′TCCTGG5′反向互补物3′GGTCCT5′反向序列5′CCAGGA3′。和通常本领域使用这些术语一样，本文描述的所有多核苷酸和多肽都是分离纯化的。本发明的组合物和方法还包括上述多肽和多核苷酸的变异体。变异体可以是天然存在的等位基因变异体，或者可以是非天然存在的变异体。本文使用的术语“变异体”包括与本发明的序列具有至少约30％、更优选至少约50％、再更优选至少约75％和最优选至少约90％的相同残基(或核苷酸或氨基酸)的任一序列。通过对两个比较序列进行序列对比，测定对比部分的相同残基数目，将该数除以本发明(或查询)序列的残基总数，并将结果乘以100，可测得相同残基的百分率。可以对多核苷酸或多肽序列进行序列对比，并可使用可公开得到的计算机算法测定具体区域中相对于另一种多核苷酸的相同核苷酸百分率。两种对比和鉴定多核苷酸序列相似性的典型算法是BLASTN算法和FASTA算法。可以使用BLASTP和FASTX算法检测多肽序列的相似性。BLASTN和BLASTP软件都可在NCBI匿名FTP服务器(ftp//ncbi.nlm.nih.gov)上的/blast/executables/之下获得。BLASTN算法2.0.6版[9-16-1998]优选用于测定本发明的变异体，该算法所设置的默认参数描述于文件并随该算法配送。BLAST算法家族(包括BLASTN和BLASTP)的使用描述于URL为http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/newblast.html.的NCBIWeb站点和出版物Altschul，StephenF.等，“空位BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白质数据库检索程序”，NucleicAcidsRes.253389-3402，1997。计算机算法FASTA可在Internet上的ftp站点ftp//ftp.virginia.edu/pub/fasta/获得。1998年8月的3.1t11版的FASTA和FASTX算法优选用于测定本发明的变异体，该算法所设置的默认参数描述于文件并随该算法配送。FASTA算法的使用描述于例如Pearson，WR和Lipman，DJ，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444-2448，1998；和Pearson，WR.，MethodsinEnzymol18363-98，1990。FASTX算法的使用描述于例如Pearson，WR等，Genomics4624-36，1997。以下的工作参数(提供E值和同一性百分率)优选用于使用BLASTN测定对比和相似性Unix运行命令blastall-pblastn-dembldb-e10-G0-E0-r1-v30-b30-iqueryseq-0results；而参数默认值是-p程序名称[String]；-d数据库[String]；-e预期值(E)[Real]；-G空位开放(open)罚分(0调用默认参数)[Integer]；-E空位延长罚分(0调用默认参数)[Integer]；-r核苷酸匹配的奖励(仅对于BLASTN)[Integer]；-v单行描述的数目(V)[Integer]；-b显示对比数目(B)[Integer]；-i查询文件[FileIn]；-oBLAST报告输出文件[FileOut]任选。对于BLASTP，优选使用以下的工作参数blastall-pblastp-dswissprotdb-e10-G0-E0-v30-b30-iqueryseq-0results；-p程序名称[String]；-d数据库[String]；-e预期值(E)[Real]；-G空位开放罚分(0调用默认参数)[Integer]；-E空位延长罚分(0调用默认参数)[Integer]；-v单行描述的数目(V)[Integer]；-b显示的对比数目(B)[Integer]；-I查询文件[FileIn]；-oBLAST报告输出文件[FileOut]任选。对于使用FASTX测定对比和相似性，优选以下的UNIX命令fastx-E10-b30-Hqueryseq＞output，而对于FASTA，优选以下的UNIX命令fasta-E2-b30-H-nqueryseq＞output。由BLASTN、BLASTP、FASTA、FASTX或相似算法获得的查询序列对一个或多个数据库序列的“命中率”对比和鉴定序列的相似部分。按照相似度和序列重叠长度顺序排列命中率。对数据库序列的命中率通常代表仅在查询序列的一部分序列长度上的重叠。BLASTN和FASTA算法还产生序列对比的“预期”值。预期值(E)表示在检索一定大小的数据库时，对于一定数目的连续序列，人们“预期”可随机发现的命中序列的数目。预期值被用做测定对数据库(诸如优选的EMBL数据库)的命中率是否代表真实相似性的重要阈值。例如，分配给命中序列的E值为0.1，其含义可解释为在一个EMBL数据库大小的数据库中，对于具有相似打分(score)的序列的对比部分，人们预期仅随机可获得0.1匹配序列。根据此标准，所述序列的对比和匹配部分相同的概率为90％。对于在对比和匹配部分E值为0.01或0.01以下的序列，使用BLASTN或FASTA算法在EMBL数据库中随机发现一个匹配序列的概率为1％或更小。按照一个实施方案，相对于本发明的每个多核苷酸的“变异”多核苷酸最好含有这样的序列其与本发明的多核苷酸相比，含有的核酸数目与本发明的每个多核苷酸都相同或略多，并且产生的E值为0.01或0.01以下。即变异体多核苷酸是任意的以下序列其与本发明的多核苷酸相同的概率至少为99％，使用设定为默认参数的BLASTN或FASTA算法检测到其E值为0.01或0.01以下。按照一个优选的实施方案，变异体多核苷酸是其核酸数目与本发明的多核苷酸相同或略多的序列，它与本发明的多核苷酸相同的概率至少为99％，使用设定为默认参数的BLASTN或FASTA算法检测到其E值为0.01或0.01以下。在某些实施方案中，变异体多核苷酸序列在严格条件下与所述多核苷酸序列杂交。本文使用的“严格条件”是指在6XSSC、0.2％SDS溶液中预清洗；在65℃、6XSSC、0.2％SDS下过夜杂交；然后在1XSSC、0.1％SDS中于65℃进行两次清洗，每次30分钟，并在0.2XSSC、0.1％SDS中于65℃进行两次清洗，每次30分钟。在其它实施方案中，所述多核苷酸和/或多肽的变异体可分离自各种分枝杆菌。在某些优选的实施方案中，所述多肽变异体与所述多肽具有相似的活性，这可通过例如按下文详述检测它们刺激人PBMC细胞增殖和/或产生细胞因子或γ干扰素的能力来评定。本发明的多肽可连接至蛋白N末端的信号(或前导)序列，所述序列共翻译或翻译后控制转移所述蛋白。所述多肽还可以连接至接头或其它序列，以易于合成、纯化或鉴定所述多肽(例如聚-His)，或增强所述多肽与固相支持物的结合。例如，多肽可连接至免疫球蛋白Fc区。本文使用的以特定“x”值为基准的术语“x聚合物”是指包含鉴定为SEQIDNO5-21的任一种多核苷酸的至少特定数目(“x”)的连续残基的多核苷酸。x值可以根据具体序列为约20至约600。本发明的多核苷酸包括含鉴定为SEQIDNO5-21的任一种多核苷酸或其变异体的至少特定数目的连续残基的多核苷酸(x-聚合物)。按照优选的实施方案，x值优选至少20，更优选至少40，再更优选至少60，而最优选至少80。因此，本发明的多核苷酸包括含鉴定为SEQIDNO5-21的多核苷酸或其中一种多核苷酸的变异体的20聚合物、40聚合物、60聚合物、80聚合物、100聚合物、120聚合物、150聚合物、180聚合物、220聚合物、250聚合物或300聚合物、400聚合物、500聚合物或600聚合物的多核苷酸。一般而言，本发明的多肽和多核苷酸可使用众多方法中的任一种制备。例如，可以通过将编码多肽的多核苷酸插入到表达载体中并在合适宿主中表达多肽而重组产生所述多肽。可以使用本领域普通技术人员已知的各种表达载体中的任一种。表达可以在任何已经用包含编码重组多肽的多核苷酸的表达载体转化或转染的合适宿主细胞中进行。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞和高等真核细胞。使用的宿主细胞优选为大肠杆菌、分枝杆菌、昆虫、酵母或哺乳动物细胞系(诸如COS或CHO)。以此方式表达的多核苷酸可以编码天然存在的抗原、其部分或其其它变异体。可按以下实施例1所述筛选母牛分枝杆菌基因组DNA文库分离本发明的多核苷酸。或者，可通过在合适的母牛分枝杆菌cDNA或基因组DNA文库中筛选与得自分离表位的氨基酸序列的简并寡核苷酸杂交的DNA序列，获得编码母牛分枝杆菌表位的多核苷酸。可设计和合成合适的简并寡核苷酸，并可如Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，CSHLPressColdSpringHarborNY，1989所述进行所述筛选。可使用聚合酶链反应(PCR)，利用本领域众所周知的技术由基因组DNA或cDNA或基因组DNA文库分离核酸探针。然后可使用分离探针进行文库筛选。本文描述的表位具有诱导免疫应答的能力，而与制备方法无关。更具体地说，如上所述，所述表位能够诱导得自分枝杆菌免疫个体的T细胞、NK细胞、B细胞或巨噬细胞增殖和/或产生细胞因子(例如产生γ干扰素和/或IL-12)。对用于评价针对表位的免疫应答的细胞类型的选择取决于需要的应答。例如，可使用本领域众所周知的方法制备包含得自分枝杆菌免疫个体的T细胞、NK细胞、B细胞和/或巨噬细胞的制备物，最容易评价IL-12产生。例如，可使用外周血单核细胞(PBMC)制备物，而不需要进一步分离细胞组分。例如可使用密度离心通过FicollTM(WinthropLaboratories，NY)制备PBMC。用于本文所述测定的T细胞可直接由PBMC纯化。或者，可使用具有抗分枝杆菌蛋白活性的富集T细胞系或具有抗各种分枝杆菌蛋白活性的T细胞克隆。例如，通过将分枝杆菌免疫个体的PBMC和分枝杆菌蛋白培养2-4周，可获得所述T细胞克隆。这使得仅分枝杆菌蛋白特异性T细胞扩增，产生仅由这样的细胞组成的细胞系。然后克隆这些细胞，并使用本领域众所周知的方法测试其与各种蛋白，以更精确地定义个体T细胞特异性。可使用例如以下描述的方法测定T细胞、NK细胞、B细胞或巨噬细胞增殖或产生细胞因子。在免疫原性表位中，可根据在上述测定中的应答强度和观察到应答的个体百分率，区分具有卓越治疗特性的本发明多肽和/或多核苷酸。另外，对于超过约25％的非分枝杆菌免疫个体的细胞，具有卓越治疗特性的表位在体外不刺激细胞增殖或产生细胞因子，由此消除缘于分枝杆菌反应型细胞的非特异性应答。因此，诱导高百分率分枝杆菌免疫个体的T细胞、NK细胞、B细胞或巨噬细胞制备物应答(对其它个体细胞制备物的应答率低)的抗原具有卓越治疗特性。具有卓越治疗特性的表位的鉴定还可以根据其在作为疫苗给予时缓解实验动物结核分枝杆菌或其它分枝杆菌感染的严重程度的能力来进行。下文详述用于实验动物的合适疫苗制备物。本发明多肽的各部分和其它变异体可以通过合成或重组方法获得。使用本领域一般技术人员周知的技术可以产生少于约100个氨基酸通常少于约50个氨基酸的合成多肽。例如，可以使用任何市售的固相技术，如氨基酸连续加入至增长的氨基酸链的Merrifield固相合成法，合成所述多肽。参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.852149-2154，1963。自动合成多肽的设备可向如PerkinElmer/AppliedBioSystems，Inc.(FosterCity，California)的供应商购买，并可按照生产商的说明书操作。可以使用标准诱变技术，如寡核苷酸定点特异性诱变，制备天然表位变异体。也可以使用允许制备截短多肽的标准技术除去DNA序列的若干部分。本发明还提供包含第一种和第二种本发明多肽的融合蛋白，或包含本发明多肽和已知结核分枝杆菌抗原(例如Andersen和Hansen，Infect.Immun.572481-2488，1989描述的38kDa抗原)的融合蛋白，以及所述融合蛋白的变异体。在相关方面，还提供包含第一种和第二种本发明多核苷酸的DNA构建物。在以下的实施例4详述包含本发明多个表位的构建物的制备以及相应重组蛋白的表达。一般来说，使用已知的重组DNA技术构建编码本发明融合蛋白的多核苷酸，以将分别编码所述第一种和第二种本发明多肽的DNA序列装配入合适的表达载体。用或不用肽接头将编码所述第一种多肽的DNA序列的3′末端连接至编码所述第二种多肽的DNA序列的5′末端，使得所述序列的读框协调允许mRNA将两种DNA序列翻译为单一的融合蛋白，此融合蛋白既保留了所述第一种多肽的生物活性，也保留了所述第二种多肽的生物活性。可以使用肽接头序列，以足以确保每个多肽折叠成其二级和三级结构的距离分开所述第一种和第二种多肽。使用本领域众所周知的标准技术将这样的肽接头序列加入到融合蛋白中。可根据以下因素选择合适的肽接头序列(1)它们能够采取柔性延伸构象；(2)它们不能采取可作用于所述第一种和第二种多肽上的功能性表位的二级结构；和(3)缺乏可与所述多肽功能性表位反应的疏水或带电残基。优选的肽接头序列包括Gly、Asn和Ser残基。在所述肽接头序列中还可以使用其它接近中性的氨基酸，如Thr和Ala。可有效用作接头的氨基酸序列包括Maratea等，Gene4039-46，1985；Murphy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA838258-8262，1986；和美国专利第4,935,233号和4,751,180号描述的氨基酸序列。所述接头序列的长度可为1至约50个氨基酸。当所述第一种和第二种多肽具有可用于分隔功能结构域并防止空间干扰的非必需N-末端氨基酸区时，不需要肽接头序列。使用本领域一般技术人员已知的技术，将编码融合蛋白的连接DNA序列克隆入合适的表达系统中。另一方面，本发明提供使用一种或多种本发明多肽或融合蛋白(或编码所述多肽或融合蛋白的多核苷酸)在患者中诱导抗病(如结核病)保护性免疫的方法。本文使用的“患者”是指任何温血动物，优选为人。患者可患有疾病，或者可以没有可检测的疾病或感染。换句话说，可诱导保护性免疫预防或治疗疾病。在相关方面，可使用本发明的母牛分枝杆菌多核苷酸和多肽激活T细胞和NK细胞、刺激人PBMC产生细胞因子(特别是Th1型细胞因子)、产生抗表位抗体和/或诱导长期记忆细胞。为了在所述方法中使用，所述多肽、融合蛋白或多核苷酸一般存在于药用组合物或疫苗中。药用组合物可以包含一种或多种多肽以及一种生理学上可接受的载体，其中每种所述多肽都可以包含一种或多种上述序列(或其变异体)。疫苗可以包含一种或多种上述多肽和免疫刺激物，诸如所述多肽掺入到其中的佐剂或脂质体。这样的药用组合物和疫苗还可以包含其它的分枝杆菌抗原，所述其它抗原加入到融合蛋白中或存在于单独的多肽中。另一方面，本发明的疫苗可以含有编码一种或多种上述多肽的多核苷酸，使得所述多肽可原位产生。在这样的疫苗中，所述多核苷酸可以存在于本领域一般技术人员已知的各种传递系统的任一种中，包括核酸表达系统、细菌表达系统和病毒表达系统。合适的核酸表达系统包含在患者中表达必须的DNA/RNA序列(诸如合适的启动子信号和终止子信号)。细菌传递系统包括给予在其细胞表面表达所述多肽的免疫原性表位的细菌(诸如卡介苗)。在一个优选的实施方案中，可以使用病毒表达系统(例如痘苗病毒或其它痘病毒、反转录病毒或腺病毒)引入所述DNA和/或RNA，所述系统可以包括使用非致病性病毒或缺陷型可复制病毒。将DNA和/或RNA加入到所述表达系统中的技术是本领域众所周知的。所述DNA还可以是“裸”DNA，例如Ulmer等，Science2591745-1749，1993中的描述和Cohen，Science2591691-1692，1993的综述。通过将裸DNA包被在有效转运至细胞中的生物可降解珠上，可增加裸DNA的吸收。给予包含DNA和/或RNA的多核苷酸序列的方法包括在美国专利第5,580,859号和5,589,466号中公开的方法。如上所述的多核苷酸疫苗可与本发明的多肽或已知的分枝杆菌抗原(如上述的38kDa抗原)同时或序贯给予。例如，可在给予编码本发明多肽的DNA后给予抗原，以便增强所述疫苗的保护性免疫效果。给予的途径和频率以及给予剂量在个体之间有所变化，可与目前牛分枝杆菌BCG免疫中使用的那些条件相同。一般而言，所述药用组合物和疫苗可以通过注射(例如皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如通过吸入)或口服给予。可在1-36周内给予1至3剂。优选以3-4个月间隔给予3剂，此后可定期进行加强免疫接种。对于个别患者可采取备选方案。合适的剂量是当如上所述给予时，多肽或多核苷酸的量能够激发患者产生足以保护所述患者免受分枝杆菌感染至少1-2年的免疫应答。一般来说，一剂含有的多肽量(或一剂多核苷酸原位产生的多肽量)为每kg宿主约1pg-约100mg，通常为每kg宿主约10pg-约1mg，优选为每kg宿主约100pg-约1μg。合适的剂量范围将根据所述患者的大小而有所变化，但通常为约0.1ml-约5ml。尽管可以在本发明的药用组合物中使用本领域一般技术人员已知的任一合适载体，但载体的类型将根据给予方式而有所变化。对于胃肠外给予，诸如皮下注射，所述载体优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服给予，可以使用以上载体中的任一种或固体载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。还可以使用生物可降解微球(例如聚乳酸半乳糖苷)作为本发明药用组合物的载体。合适的生物可降解微球公开于例如美国专利第4,897,268号和第5,075,109号。在本发明的疫苗中可以使用各种免疫刺激物中的任一种，诸如佐剂，以非特异性增强免疫应答。大多数佐剂包含用来避免抗原快速分解代谢的物质(诸如氢氧化铝或矿物油)和免疫应答的非特异性刺激剂(诸如类脂A、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、结核分枝杆菌或以下论述的母牛分枝杆菌)。合适的佐剂可市售获得，如弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(DifcoLaboratories，Detroit，MI)，以及Merck佐剂65(MerckandCompany，Inc.，Rahway，NJ)。其它合适的佐剂包括明矾、生物可降解微球、单磷酰脂A和QuilA。提供以下的实施例是起说明作用，而不是起限制作用。实施例1克隆和选择免疫原性母牛分枝杆菌表位于37℃在培养基90(酵母提取物，2.5g/l；胰蛋白胨，5g/l；葡萄糖，1g/l)中培养母牛分枝杆菌(ATCC保藏号15483，Rockville，MD)4天。按照标准方法由这些细胞分离基因组DNA，然后在产生约0.25kbDNA片段的条件下用限制性内切核酸酶Sau3A消化。使用QIAquickPCR纯化系统(Qiagen，Venlo，TheNetherlands)纯化所述片段。为表达三种不同读框的克隆母牛分枝杆菌DNA，通过插入用三种不同3′引物扩增的人生长激素信号肽(以促进重组蛋白分泌)修饰pcDNA3表达载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。这些引物允许将1个或2个额外碱基对插入到PCR产物中，以移动所表达多肽的读框。所述引物为AD105(人生长激素5′引物；SEQIDNO1)和三种人生长激素(hGH)3′引物AD106、AD107和AD108(分别为SEQIDNO2-4)。通过用限制性内切核酸酶BsgII消化由这些PCR片段中除去前导序列切割位点下游的大部分hGH序列。然后将hGHPCR片段克隆入pcDNA3表达载体中，然后用限制性内切核酸酶HindIII和BamHI消化。SEQIDNO5-7给出了插入片段的核苷酸序列，SEQIDNO61-63分别提供相应的氨基酸序列。通过将如上所述制备的0.25kb母牛分枝杆菌PCR片段克隆入嵌合pcDNA3/人生长激素载体(pcDNA3-hGH1′、pcDNA3-hGH2′和pcDNA3-hGH3′)的BamHI克隆位点，构建三种表达文库(三个读框的各个文库)。用所述文库构建物转化的细菌菌落制备影印板(replicaliftmasterplate)并储存。将由这些菌落制备的质粒DNA分为500个库，每库含有40-50个质粒DNA。使用脂质转染胺试剂(BRLLifeTechnologies，GaithersburgMD)将所述DNA转染入COS7细胞中，并利用脾细胞测定检测每组产物的免疫原性特性，其中如下所述用ELISA测定热灭活母牛分枝杆菌首次激发免疫小鼠脾细胞培养物产生IFN-γ。将激发免疫应答(以脾细胞测定中增加IFN-γ产生的能力测定)的重组多肽编码质粒库再细分为更小的库，每个库含有10个质粒，再将这些库转染入COS7细胞中。如上所述对这些细胞的培养上清液进行脾细胞测定。三轮筛选之后，鉴定出120个编码重组多肽的质粒，所述重组多肽刺激热灭活母牛分枝杆菌免疫小鼠脾细胞产生IFN-γ。使用另外两种测定筛选用这些质粒转染的120个COS7细胞培养上清液，所述两个测定即小鼠记忆测定和人外周血单核细胞(PBMC)测定。在小鼠长期记忆测定中，用亚致死剂量的104菌落形成单位(CFU)结核分枝杆菌注射小鼠。4周后，用抗生素再治疗小鼠4周，以治愈小鼠的结核分枝杆菌感染，接着是4周的静止期。第二次注射活结核分枝杆菌(5×105CFU)4天后，使用上述脾细胞测定检测质粒产物的免疫原性。在PBMC测定中，以其诱导分枝杆菌免疫人供体外周血细胞T细胞增殖和产生IFN-γ的能力筛选120个质粒转染COS7细胞培养上清液。已知这些供体为PPD(结核分枝杆菌的纯化蛋白衍生物)阳性，证实其T细胞在PPD作用下发生增殖并产生IFN-γ。在含补加10％(v/v)自体血清、青霉素(60μg/ml)、链霉素(100μg/ml)和谷胺酰胺(2mM)的RPMI1640的培养基中培养供体PBMC和COS7培养上清液。3天后，由每孔中取出50μl培养基，如下所述测定IFN-γ水平。再培养平板4天，然后用1μCi/孔的氚化胸苷脉冲处理18小时，收获细胞并使用闪烁计数器测定氚摄入。在两个复份测定中刺激增殖的水平比在单独培养基培养细胞观测到的增殖高两倍的上清液判为阳性。如下使用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测IFN-γ。通过将各孔与1μg/ml针对人IFN-γ的小鼠单克隆抗体(Endogen，Wobural，MA)磷酸缓冲盐水(PBS)溶液于4℃温育4小时，使所述抗体包被ELISA板。在室温下用含0.2％Tween20的PBS封闭各孔1小时。然后在PBS/0.2％Tween20中清洗所述板4次，并在ELISA板中以培养基1∶2稀释样品，于室温下温育过夜。再清洗所述板，向每孔中加入在PBS中稀释至1μg/ml的生物素化多克隆兔抗人IFN-γ血清(Endogen)。然后于室温下温育所述板1小时，清洗并加入在PBS中以1∶4,000稀释的偶合辣根过氧化物酶的抗生物素蛋白A(VectorLaboratories，Burlingame，CA)。再于室温温育1小时后，清洗板并加入邻苯二胺(OPD)底物。10分钟后用10％(v/v)HCl终止反应。检测490nm的光密度(OD)。在两个复份测定中OD高于单独培养基培养细胞的平均OD两倍的培养上清液判为阳性。根据这两个测定的结果鉴定出编码含免疫原性决定簇或表位的重组多肽的59个质粒。发现这些表位激发小鼠和人免疫应答，并与诱导长期应答的结核分枝杆菌免疫原性决定簇交叉反应。测试了这些质粒在如下的结核病小鼠模型中诱导保护性免疫的能力。在麻醉小鼠的胫骨前肌IM注射每种质粒(100μgDNA)，间隔2周注射三次。9周后，用结核分枝杆菌(5×105CFU)攻击小鼠。在第12周制备肺和脾的器官匀浆，并在补加油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(OADC)的7H9培养基上平板培养，以测定每种匀浆存在的CFU数。温育两周后记录结果。使用以上描述的方法选择8个含免疫原性表位的质粒。在这些构建物中鉴定出推定的可读框(ORF)后，如上所述将仅含有ORF部分的母牛分枝杆菌片段亚克隆入pcDNA3-hGH′中。这些质粒称为DNA5、DNA9、DNA26、DNA27、DNA29、DNA37、DNA44和DNA45。在DNA9中鉴定出三种称为A、B和C的ORF。可读框B和C为反向，废弃。单独克隆ORFA，获得的质粒叫做DNA9A。SEQIDNO13-21分别给出了所测得的DNA5、DNA9A、DNA26、DNA27、DNA29、DNA37、DNA42、DNA44和DNA45插入片段的基因组DNA序列，SEQIDNO69-77分别提供了相应ORF的预期氨基酸序列。在质粒DNA5和DNA27的插入片段中鉴定出一个以上的表位。这些表位通过克隆不能分开，在所有的测定中测试均为多表位。SEQIDNO8-12分别给出了DNA5的表位1、表位2和表位3以及DNA27的表位1和表位2的测定基因组DNA序列，SEQIDNO64-68分别提供了相应的预期氨基酸序列。使用FASTA计算机算法对比测定的表位DNA序列和EMBLDNA数据库中的序列。使用FASTX计算机算法对比相应的预期蛋白序列(6个读框的每一个中的DNA翻译的蛋白)和SwissProt数据库中的序列。1999年3月21日比较SEQIDNO8-12提供的DNA序列和EMBLDNA数据库中的序列(使用FASTA)，并比较SEQIDNO64-77提供的氨基酸序列与SwissProt数据库中的序列(使用FASTX)。使用FASTX如上所述测定发现，DNA5表位2、DNA27表位1、DNA9A、DNA29、DNA37、DNA44和DNA45的预期氨基酸序列(分别由SEQIDNO65、67、70、73、74、76和77提供)与SwissProt数据库中的序列的同一性小于50％。使用FASTX如上所述测定发现，DNA5表位1和3的预期氨基酸序列(分别由SEQIDNO64和66提供)与SwissProt数据库中的序列的同一性小于75％。未发现与DNA27表位2和DNA26的预期氨基酸序列(分别由SEQIDNO68和71提供)匹配的序列。以下的表1显示了如上所述使用FASTX比较本发明的氨基酸序列与SwissProt数据库中的序列的结果，其中“相同残基数”为对比部分的相同残基数。表1实施例2在原核细胞和真核细胞中表达重组表位将表位DNA亚克隆入载体中，以在细菌和真核细胞中表达多肽。细菌表达载体是改良型pET16载体(Novagen，Madison，WI)。除了DNA9之外，所有质粒的插入片段都用引物AD136和AD133(分别为SEQIDNO22和23)扩增，并通过平端连接入EcoRI消化并用DNA聚合酶PfuI(Stratagene，LaJolla，CA)末端补平的pET16载体中进行克隆。DNA9A的插入片段用AD250和AD251(分别为SEQIDNO24和25)扩增，并如上所述克隆入pET16载体中。为在真核细胞中表达所述多肽，修饰pcDNA3载体(Invitrogen)，以在克隆位点的3′末端包括一个组氨酸标记。这可通过将双链寡核苷酸AD180/AD181克隆入BamHI和EcoRI消化的pcDNA3中完成。SEQIDNO26和27分别给出了寡核苷酸AD180和AD181的序列。使用pcDNA3-hGH′构建物作为DNA模板，用hGH特异性N端5′引物AD134(SEQIDNO28)和表位特异性3′末端引物扩增质粒插入片段。SEQIDNO29-37分别列出了表位特异性3′引物AD151(DNA5)、AD153(DNA26)、AD154(DNA27)、AD155(DNA29)、AD158(DNA42)、AD159(DNA44)、AD160(DNA45)、AD167(DNA37)和AD182(DNA9)的序列。再次修饰该载体，以去除hGH前导序列和表达序列之间的多余序列(42个核苷酸)，使得此构建物中的hGH′序列被简化为仅余前导序列和hGH序列的前5个N-末端氨基酸。使用pcDNA3-hGH3′构建物作为模板，使用引物AD105(SEQIDNO1)和AD222(SEQIDNO38)经PCR扩增缩短融合配偶体。在HindIII和BamHI位点克隆入pcDNA3-His，获得的构建物称为pcDNA3-hGHls/His。SEQIDNO39给出了克隆入pcDNA3-hGH-ls中的hGH-融合配偶体的测定DNA序列，对应的氨基酸序列示于SEQIDNO78。使用引物AD233和AD226(分别为SEQIDNO40和41)通过PCR扩增制备由DNA9A插入片段组成的构建物。实施例3重组表位构建物的免疫原性本实施例描述了用8个选择的DNA或重组多肽形式的重组表位进行免疫原性研究的结果。A.体外刺激人外周血单核细胞(PBMC)增殖和分泌γ干扰素(IFN-γ)将pET16细菌表达系统表达的重组表位(1和10μg)与人PBMC于37℃培养。48小时后，按照标准方法用酶联免疫测定(ELISA)检测IFN-γ分泌。用氚化胸苷脉冲平行培养物，并使用DNA合成评价PBMC增殖。为了比较，还将细胞与结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物(PPD)一起培养，并将所述细胞与PBS一起培养作为阴性对照。如表2所示，所有的重组表位都能够刺激至少某些PBMC样品产生IFN-γ。在所测试的12个PBMC样品中，10个样品为PPD阳性，即这些样品的PBMC当与PPD培养时产生IFN-γ，而2个样品为PPD阴性。当产生的IFN-γ量至少比PBS对照样品产生的IFN-γ高3倍时认为PBMC反应为阳性。重组表位5(对应于DNA5)和44(对应于DNA44)刺激100％的PPD+样品产生IFN-γ。重组表位27(对应于DNA27)刺激80％的PPD+样品产生IFN-γ。重组表位26和37(分别对应于DNA26和DNA37)刺激70％的PPD+样品产生IFN-γ，而表位45(对应于DNA45)刺激20％的PPD+PBMC样品。PPD-PBMC样品对任何重组表位均没有明显反应。这证明所述表位在人体内具有免疫原性，并触发预先接触分枝杆菌的供体样品的回忆反应。表2重组表位刺激人PBMC产生IFN-γ*结果以ngIFN-γ/ml表示。由人PBMC样品对PPD和重组表位二者的增殖反应进一步证明了所述表位对人的免疫原性。以刺激指数表示所述重组表位刺激PBMC增殖的能力。当增殖刺激物比仅有培养基对照产生的平均背景增殖高5倍时，则认为增殖刺激物阳性。如表3所示，发现所有的重组表位都具有刺激至少某些人PBMC样品的PBMC增殖的能力。重组表位26和27刺激92％的所述样品的PBMC增殖，而重组表位5、37和44对83％的所述样品刺激增殖。表位45对17％的所述样品刺激PBMC增殖。PPD对PBMC的刺激作用为83％。表3对PBMC增殖的刺激作用*用刺激指数表示人PBMC增殖的结果。B.用DNA表位免疫小鼠在注射pcDNA-hGH′/His或pcDNA3-hGHls/His构建物的8个重组表位的编码DNA之后，在BALB/cByJ小鼠中诱导抗随后的结核分枝杆菌感染的保护性免疫。在随后用结核分枝杆菌感染后观察保护性免疫诱导，当与未免疫对照小鼠的平均CFU相比，肺匀浆CFU平均下降0.5log时，则认为诱导的保护性免疫为阳性。没有插入片段的质粒用做对照。还将表位DNA免疫后的CFU减少与已知的牛分枝杆菌BCG的免疫原性进行了比较。结果清楚显示，所有测试小鼠的CFU均减少，提示所述重组表位DNA诱导保护性免疫。在6个组中，CFU下降超过50％，3个组的CFU下降与注射牛分枝杆菌BCG诱导的CFU下降相当。表4通过用8个pcDNA-hGH′/His或pcDNA3-hGHls/His构建物遗传免疫小鼠诱导保护性免疫如下评价用8个pcDNA-hGH′/His或pcDNA3-hGHls/His构建物遗传免疫时诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、细胞因子(IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-10)以及增殖和抗体反应。CTL测定使用MHC单倍型匹配靶细胞BALB-3T3(ATCC保藏号CRL-163，美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)，按照标准两步法检测DNA免疫BALB/cByJ小鼠脾细胞的溶细胞(CTL)活性。通过用8个pcDNA-hGH′/His或pcDNA3-hGHls/His表位DNA构建物转染BALB/3T3细胞，制备靶细胞。通过遗传霉素选择(G418；GibcoBRLLifeTechnologies)产生稳定转染细胞系，并通过有限稀释分离单个细胞。使用引物AD105和AD181(分别为SEQIDNO1和27)通过RT-PCR选择表达表位的克隆。在用匹配表位DNA转染的丝裂霉素处理BALB-3T3细胞存在下，在补充10％FCS的cDMEM中培养DNA免疫小鼠脾细胞，以体外再刺激细胞毒性T细胞。于37℃在10％CO2下温育培养物6天。通过温育每种刺激细胞培养物的一部分和用51Cr脉冲的DNA匹配靶细胞，检测细胞培养物上清液中释放的51Cr，从而监测溶细胞活性。如表5所示，检测到4种测试DNA构建物免疫小鼠的脾细胞具有特异性CTL活性。细胞因子和增殖反应在用重组表位体外再刺激后评价DNA免疫BALB/cByJ小鼠脾细胞的细胞因子产生和增殖反应。分别如上所述通过ELISA和3H-胸苷脉冲检测细胞因子和增殖反应。如表5所示，6个测试组的脾细胞产生Th1细胞因子IFN-γ。在刺激细胞的上清液中未检测到Th2细胞因子(例如IL-4、IL-6和IL-10)。增殖反应低，且只在两个免疫组小鼠脾细胞中检测到。抗体反应在注射最后一次DNA之后2周收集三种DNA免疫BALB/cByJ小鼠的血样，并按照标准方法制备血清。用ELISA检测抗表位抗体存在与否。用500ng重组表位包被微量滴定板各孔。通过将连续稀释的血清加入到各孔中检测抗体滴度。按照如上所述的ELISA方法检测抗体滴度。如表5所示，在测试的两个血样中检测到抗表位抗体。还使用标准方法进行ELISA检测，以测定所述抗体是属于IgG1亚型还是属于IgG2a亚型。结果显示所述抗体属于IgG2a亚型，IgG2a亚型是Th1抗体应答的特征。在表5中概述的数据表明，用表位DNA免疫在小鼠中诱导免疫应答。而且，在所述DNA免疫小鼠中检测到的细胞应答和体液应答表明产生的是Th1型应答。表5通过用8个pcDNA-hGH′/His或pcDNA3-hGHls/His构建物遗传免疫小鼠诱导的细胞毒性淋巴细胞诱导、细胞因子反应、增殖和抗体反应*显示的数据为三只小鼠脾细胞的裂解平均百分数。扣除了对照细胞的非特异性裂解。**显示的数据为由三只小鼠的三份脾细胞培养物获得的平均IFN-γ(ng/ml)。对照细胞产生的背景IFN-γ为5-7ng/ml。***NT＝未测试。实施例4母牛分枝杆菌多表位构建物的克隆策略装配实施例4测定的8个表位，以形成多表位构建物。具体来说，用含BglII5′-延伸和BamHI3′-延伸的引物扩增所述DNA，随后将其克隆入pcDNA3/hGHls/His的BamHI位点。引物为AD223、AD226、AD229、AD230、AD231、AD232、AD233、AD234、AD235、AD236、AD256、AD258、AD259、AD260、AD261和AD262(分别为SEQIDNO40-55)。首先将质粒DNA9A的插入片段克隆入pcDNA3-hGHls/His的BamHI位点。仅在克隆接头3′末端重构所述载体的BamHI位点，并将DNA5以外的所有其它插入片段序贯克隆入相同的位点。最后通过平端连接将质粒DNA5的插入片段克隆入pcDNA3/hGHls/His的末端补平BamHI位点。在此步骤之后，将各种组合的表位克隆入pcDNA3-hGHls/His载体。SEQIDNO56-58分别显示了由8聚体多表位组成的三种多表位构建物(称为ME/A、ME/B和ME/D)的测定DNA序列，SEQIDNO79-81分别显示了预期的相应氨基酸序列。这些多表位构建物中的每一个都包括所述8个表位中的每一个，但顺序不同。为了在细菌中表达多表位重组蛋白，将质粒ME/A、ME/B和ME/D的插入片段亚克隆入改良型表达载体pET16。所有的8聚体多表位DNA组合都分别在其5′和3′末端具有DNA9A和DNA5。使用引物AD272和AD273(分别为SEQIDNO59和60)扩增质粒插入片段，并通过平端连接将纯化的扩增片段克隆入EcoRI消化并用DNA聚合酶PfuI(Stratagene)补平末端的pET16载体。按照生产商的方法使用大肠杆菌宿主细胞表达重组蛋白并使用标准方法纯化。实施例5用母牛分枝杆菌多表位构建物免疫小鼠本实施例阐明对BALB/cByJ小鼠注射DNA或重组多肽形式的多表位构建物后其抗随后的结核分枝杆菌感染的保护性免疫。将BALB/cByJ小鼠分为三组，每组6只，接受不同处理。第1组小鼠用1剂500μg牛分枝杆菌BCG或PBS腹膜内免疫。第2组小鼠用100μgME/DDNA或空载体DNA以三周的间隔在小鼠胫骨前肌肌内免疫三次。第3组的小鼠用1或2剂的50μg在IFA中的重组ME/D或50μg在IFA中的对照蛋白以三周的间隔腹膜内免疫。由非天然存在蛋白组成的对照蛋白GV14B得自分枝杆菌延伸因子G的母牛分枝杆菌同源物的编码DNA，将其以反向克隆入pET16g3中。最后一次免疫后三周，用活结核分枝杆菌(5×105CFU)攻击小鼠。再过三周后制备肺和脾的器官匀浆，并在补加油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(OADC)的7H9培养基上平板培养，以测定每种匀浆中存在的CFU数。温育两周后记录结果。在随后用结核分枝杆菌感染后观察保护性免疫诱导，当与未免疫对照小鼠的平均CFU相比，肺和脾匀浆CFU平均下降0.5log时，则认为诱导的保护性免疫为阳性。比较ME/DDNA或重组ME/D多肽免疫后的CFU降低与已知的牛分枝杆菌BCG的免疫原性。结果(图1)显示，ME/DDNA以及重组ME/D构建物免疫小鼠的肺和脾的CFU减少。肺和脾二者CFU的下降高于用单一表位构建物免疫免疫后的肺CFU下降(表4)，这证明了ME/DDNA和rME/D多肽的保护性免疫。实施例6母牛分枝杆菌多表位构建物的免疫原性本实施例描述了用3种DNA或重组多肽形式的多表位构建物进行免疫原性研究的结果。A.重组多表位构建物ME/A、ME/B和ME/D刺激小鼠淋巴结细胞体外增殖和分泌IFN-γ根据其诱导小鼠淋巴结细胞的T细胞增殖和IFN-γ的能力筛选重组多表位构建物rME/A、rME/B和rME/D。为了进行此测定，在每个爪垫用10μg以等体积IFA稀释的重组多表位构建物rME/A、rME/B和rME/C皮下免疫BALB/cByJ小鼠。对照组小鼠接受在IFA中的PBS。9天后处死小鼠，取出淋巴结。在0、0.125、0.25或0.5μMrME/A、rME/B或rME/D以及对照蛋白GV14B存在下，在含补加10％(v/v)自体血清、青霉素(60μg/ml)、链霉素(100μg/ml)和谷胺酰胺(2mM)的DMEM的培养基中培养淋巴结细胞。3天后，由每孔中取出50μl培养基，如上所述测定IFN-γ水平。再培养所述平板4天，然后用1μCi/孔的氚化胸苷脉冲18小时。收获细胞并使用闪烁计数器测定氚摄取。将在两个复份测定中刺激增殖的水平比单独培养基培养细胞观察到的增殖高两倍的上清液判为阳性。图2A-D显示了小鼠增殖实验的结果。所有三种重组多表位构建物均诱导免疫小鼠淋巴结细胞增殖反应。三种重组多表位构建物rME/A、rME/B和rME/D诱导的增殖水平(分别为图2A、B和C)相似，表明所述构建物抗原性相同。PBS免疫的对照小鼠未出现增殖反应(图2D)。图3A-C分别显示了刺激rME/A、rME/B或rME/D免疫小鼠淋巴结细胞分泌的IFN-γ水平。所有三种重组多表位构建物均刺激淋巴结细胞分泌IFN-γ，rME/B的刺激水平最高(图3B)。PBS刺激的对照小鼠细胞分泌不能检测量的IFN-γ(图3D)。这些结果表明，用所述多表位构建物免疫在小鼠中诱导Th1免疫应答。B.重组多表位构建物ME/D和ME/DDNA体外刺激不同途径免疫小鼠的淋巴结细胞和脾细胞增殖和分泌IFN-γ在这些实验中，用所述重组多表位构建物rME/D或其DNA形式皮下、腹膜内或肌内免疫小鼠，刺激小鼠的淋巴结细胞或脾细胞以诱导T细胞增殖和产生IFN-γ。或者用一剂在IFA中的10μgrME/D在每个爪垫皮下、或者用一剂在IFA中的50μgrME/D腹膜内、或者用三剂100μgME/DDNA以三周间隔肌内免疫BALB/cByJ小鼠。对照小鼠用PBS经所述三种不同免疫途径免疫。9天后处死经皮下和腹膜内途径免疫的小鼠，取出淋巴结细胞(皮下免疫)或脾细胞(腹膜内免疫)。在最后一次肌内注射免疫后15天收获免疫小鼠的脾细胞。如上所述测定这些细胞的增殖和产生的IFN-γ。图4和图5显示了这些实验的结果。在图4A中，显示了rME/D或ME/DDNA免疫小鼠的淋巴结细胞和脾细胞的特异性增殖反应。相比之下，图4B显示了对照小鼠的低增殖。同样，刺激rME/D或ME/DDNA免疫小鼠的淋巴结细胞和脾细胞分泌IFN-γ(图5A)，而PBS免疫对照小鼠的淋巴结细胞和脾细胞分泌低水平的IFN-γ。C.多表位构建物的单个表位体外刺激重组多表位构建物rME/D或ME/DDNA经不同途径免疫小鼠的淋巴结细胞和脾细胞增殖和分泌IFN-γ在这些实验中，用重组形式的单个表位DNA5、DNA9、DNA26、DNA27、DNA29、DNA37、DNA44和DNA45再刺激重组多表位构建物rME/D或DNA形式的多表位构建物ME/D经不同免疫途径免疫小鼠的淋巴结细胞和脾细胞。实验步骤与以上的概述相同。这些实验的结果显示于图6A-B和图7A-B。在用表位DNA5、DNA9A、DNA26、DNA37和DNA44再刺激的细胞中检测到特异性增殖反应和IFN-γ分泌(图6A和图7A)。表位DNA27、DNA29和DNA45在至少一个免疫组显示增殖和IFN-γ分泌。在PBS免疫对照小鼠的细胞中观察到低水平的增殖和IFN-γ产生(图6B和图7B)。数据表明当所述表位作为多组分免疫原的组成部分提呈至免疫系统时，全部单独具有抗原性。D.细胞因子产生如下所述测定用DNA形式的多表位构建物ME/D免疫并用rME/A或rME/D再刺激的小鼠脾细胞产生的细胞因子。用三剂100μgME/DDNA以三周的间隔肌内免疫BALB/cByJ小鼠。最后一次注射后15天，处死小鼠并取出脾细胞。用rME/A、rME/D或对照蛋白GV14B再刺激脾细胞，并按照标准方法筛选产生细胞因子的上清液。表6给出了脾细胞产生细胞因子的情况。表6MEDNA免疫的BALB/cByJ小鼠脾细胞分泌的细胞因子*以pg/ml检测细胞因子浓度，标准误差＜10％如表6所示，rME/A和rME/D刺激小鼠的脾细胞分泌IL-2和IL-6。IL-2是Th1型免疫应答期间分泌的细胞因子，这提供了进一步的证据表明所述多表位构建物激发Th1型免疫应答。细胞因子IL-6在针对结核病的小鼠免疫中起重要作用(Ladel等，Infec.Imm.654883-4849，1997)。经检测，未分泌Th2型细胞因子IL-4。E.抗体产生在最后一次DNA注射后两周收集ME/D免疫BALB/cByJ小鼠的血样，并按照标准方法制备血清。通过ELISA检测抗-ME/D抗体存在与否。如图8B所示，检测出与rME/A和rME/D反应的高滴度IgG2a抗体，但没有IgG1抗体(图8A)。IgG2a抗体的存在是Th1型免疫应答的特征。F.由重组表位和重组多表位构建物rME/D在小鼠中诱导长期记忆应答如下所述测定在结核分枝杆菌感染并用重组表位rDNA5、rDNA9A、rDNA26、rDNA27、rDNA37、rDNA44或rDNA45或者重组多表位构建物ME/D免疫小鼠中诱导的长期记忆应答。在小鼠长期记忆测定中，用亚致死剂量的104菌落形成单位(CFU)结核分枝杆菌注射BALB/cByJ小鼠。4周后，用抗生素再治疗小鼠4周，以治愈小鼠的结核分枝杆菌感染，接着是8周的静止期。第二次注射活结核分枝杆菌(5×105CFU)3天后，使用上述脾细胞测定检测重组构建物免疫原性。用2μM重组表位或用1、0.33、0.11、0.03或0.01μMrME/D刺激脾细胞。在图9A-C中显示了在脾细胞测定中测定的IFN-γ产生水平。用无关蛋白GV14B刺激对照小鼠的脾细胞(图9B)。在本实验中的其它对照包括仅用培养基、2μg/mlConA、10μg/mlPPD和10μg/ml母牛分枝杆菌刺激(图9A)。重组ME/D刺激结核分枝杆菌感染小鼠的记忆T细胞，以剂量依赖方式产生大量IFN-γ(图9B)。在此测定中产生IFN-γ表明ME/D与诱导长期免疫应答的结核分枝杆菌抗原交叉反应。与结核分枝杆菌抗原交叉反应的抗原决定簇似乎位于表位DNA5、DNA9A、DNA26、DNA27和DNA44上(图9B)。实施例7用重组单表位和重组多表位构建物刺激人外周血单核细胞(PBMC)的作用A.刺激人外周血单核细胞(PBMC)体外增殖和分泌γ干扰素(IFN-γ)于37℃培养pET16细菌表达系统表达的重组表位和重组多表位构建物以及人PBMC。48小时后，如上所述用酶联免疫测定(ELISA)检测IFN-γ分泌。用氚化胸苷脉冲平行培养物，并使用DNA合成评价PBMC增殖。这些实验的结果示于图10A-B和图11A-B。重组多表位构建物刺激人PBMC分泌IFN-γ和增殖(分别为图10A和B)。这些反应是剂量依赖性的，并比单个重组表位诱导的反应强度高(图11A和B)。B.重组单表位和重组多表位构建物rME/A和rME/D刺激人PBMC体外分泌细胞因子如下用重组单表位或重组rME/A或rME/D体外再刺激后评价人PBMC产生的细胞因子。用2μM重组单表位rDNA5、rDNA9A、rDNA26、rDNA27、rDNA29、rDNA37、rDNA44或rDNA45，或者0.5μMrME/A或rME/D刺激细胞。对照组细胞用2μMGV14B或10μg/mlPPD刺激。按照标准方法用ELISA检测细胞因子反应。如下表7所示，用所述重组单表位或rME/A或rME/D刺激的人PBMC产生Th1细胞因子IFN-γ和TNF-α。这些重组表位还诱导分泌IL-10。在刺激细胞的培养上清液中未检测出Th2细胞因子IL-5。对照抗原刺激分泌低水平细胞因子，并且在用PPD刺激后人PBMC分泌所有所测试的细胞因子。表7用重组单表位和rME体外刺激后人PBMC分泌的细胞因子实施例8用重组RME/D免疫后刺激猕猴淋巴细胞增殖免疫三组猕猴，每组4只，以测试重组多表位构建物rME/D的免疫原性。以PBMC增殖测定检测淋巴细胞增殖。第I组的猕猴用总体积0.1ml的PBS弗氏不完全佐剂(IFA)皮内免疫。第II组的猕猴用33μg在IFA中的rME/D(总体积0.1ml)皮内免疫，而第III组的猕猴用10μg在IFA中的rME/D(总体积0.1ml)皮内免疫。在第0周和第6周进行两次免疫。免疫后12周由每只猕猴采血样。每只猕猴的全血以1∶5稀释，并用对照培养基(补加10％(v/v)自体血清、青霉素(60μg/ml)、链霉素(100μg/ml)和谷胺酰胺(2mM)的RPMI1640)刺激，所述对照培养基在1ml总培养体积中包含阳性对照植物凝集素(PHA，10μg/ml)、PPD(10μg/ml)、母牛分枝杆菌(10μg/ml)、rME/D(1μg/ml)或对照重组蛋白GV-14B(1μg/ml)。培养平板72小时，然后再用1μCi/孔的氚化胸苷脉冲18小时，收获并使用闪烁计数器测定氚摄取。淋巴细胞增殖的结果示于表8。表8PHA、PPD、母牛分枝杆菌、rME/D或rGV-14刺激的猕猴血样淋巴细胞增殖如表8所示，重组多表位构建物rME/D在第II组和第III组的免疫猕猴中诱导的PBMC细胞增殖反应与阳性对照(PHA)诱导的增殖反应相当。用PPD、母牛分枝杆菌或rGV-14刺激后未记录到增殖。尽管为了清楚理解本发明已经利用附图和实施例相当详细地描述了本发明，但可以在不偏离本发明范围的情况下对本发明进行改变和修饰，而本发明范围仅由所附权利要求书的范围所限定。权利要求1.一种包含选自SEQIDNO61-77序列的氨基酸序列的分离多肽。2.一种包含选自以下序列的氨基酸序列的分离多肽(a)根据计算机算法FASTX测定，与SEQIDNO61-63、65和67-77中的任一个序列具有至少约30％相同残基的序列；(b)根据计算机算法FASTX测定，与SEQIDNO61-63、65和67-77中的任一个序列具有至少约50％相同残基的序列；(c)根据计算机算法FASTX测定，与SEQIDNO61-77中的任一个序列具有至少约75％相同残基的序列；(d)根据计算机算法FASTX测定，与SEQIDNO61-77中的任一个序列具有至少约90％相同残基的序列。3.一种编码权利要求1和2中任一项的多肽的分离多核苷酸。4.权利要求3的分离多核苷酸，其中所述多核苷酸含有选自SEQIDNO8-21序列及其互补物的序列。5.一种含有选自以下序列的序列的分离多核苷酸(a)根据计算机算法BLASTN测定，与SEQIDNO8-21中任一个序列具有至少约30％相同残基的序列；(b)根据计算机算法BLASTN测定，与SEQIDNO8-21中任一个序列具有至少约50％相同残基的序列；(c)根据计算机算法BLASTN测定，与SEQIDNO8-21中任一个序列具有至少约75％相同残基的序列；(d)根据计算机算法BLASTN测定，与SEQIDNO8-21中任一个序列具有至少约90％相同残基的序列；(e)(a)、(b)、(c)或(d)序列的互补物。6.一种包含权利要求3-5中任一项的至少一种多核苷酸的DNA构建物。7.权利要求6的DNA构建物，其中所述构建物包含选自SEQIDNO56-58的序列。8.一种用权利要求6和7中任一项的DNA构建物转化的宿主细胞。9.一种包含权利要求1和2中任一项的至少一种多肽的融合蛋白。10.权利要求9的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含选自SEQIDNO79-81的序列。11.一种包含权利要求1和2中任一项的至少一种多肽和生理学上可接受载体的组合物。12.一种包含权利要求3-5中任一项的至少一种多肽和生理学上可接受载体的组合物。13.一种包含权利要求9的至少一种融合蛋白和生理学上可接受载体的组合物。14.一种包含权利要求6的至少一种DNA构建物和生理学上可接受载体的组合物。15.一种包含权利要求1和2中任一项的至少一种多肽和免疫刺激物的组合物。16.一种包含权利要求3-5中任一项的至少一种多核苷酸和免疫刺激物的组合物。17.一种包含权利要求9的至少一种融合蛋白和免疫刺激物的组合物。18.一种包含权利要求6的至少一种DNA构建物和免疫刺激物的组合物。19.一种增强患者免疫应答的方法，该方法包括给予所述患者权利要求11-18中任一项的组合物。20.权利要求19的方法，其中所述免疫应答为Th1应答。21.权利要求19的方法，其中所述组合物激活至少一种选自T细胞和NK细胞的细胞。22.权利要求19的方法，其中所述组合物刺激产生细胞因子。23.权利要求19的方法，其中所述组合物诱导长期记忆细胞。24.一种治疗患者疾病的方法，该方法包括给予所述患者权利要求11-18中任一项的组合物，其中所述疾病选自免疫性疾病、感染性疾病和癌症。25.权利要求29的方法，其中所述疾病为结核病。专利摘要本发明提供包含母牛分枝杆菌蛋白的免疫原性表位的多肽、编码所述多肽的多核苷酸和包含至少一种所述多肽的融合蛋白,以及包含至少一种本发明多核苷酸的DNA构建物。可使用包含所述多肽、多核苷酸、融合蛋白和/或DNA构建物的组合物治疗感染性疾病和免疫性疾病。文档编号C12N5/10GKCN1378560SQ00812493公开日2002年11月6日申请日期2000年7月10日发明者A·德尔凯雷申请人:吉尼西斯研究及发展有限公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan