专利名称:提高植物细胞转基因效率的方法
技术领域：
本发明涉及提高植物细胞转基因效率的方法。
技术背景农杆菌转基因法所具有的优点是，转基因效率高，基因拷贝数少，而且不会使T-DNA特定区域片断化，由于培养时间短，所以获得的转导体变异小。故此，农杆菌转基因法被广泛应用于各种植物，它是植物转基因的最有效方法。
虽然农杆菌法是非常好的植物转基因方法，但是实际上这种转基因是否能成功以及转导效率如何均依赖于植物的种类、基因型以及所使用的植物组织，由于这些要素的原因它们会产生很大的差异(Potrykus etal.1998(参考文献(33)))。也就是说，除了有的植物在转基因中没有成功外，还有很多植物仅有极少部分的品种可以转导。有的植物其可利用的组织非常有限不能大量地用作植物材料。通过基因重组培育更为实用的品种，在培育很多转基因植物之后，必需筛选能够进行转基因的系统。然而，容易得到转导体的作物其种类还是有限。因此，现在亟需开发能够解决上述问题的改进技术方案。
农杆菌介导的转基因法尽管由于植物种类不同所提供的实验材料和培养基的组成等有差异，但是在下面所述的操作中几乎完全一样，即将植物组织加入农杆菌悬浮液中，经共培养后，筛选转基因的细胞，培育转基因植物。通常根据需要对植物组织进行灭菌处理，使农杆菌感染植物，除此之外不做特别处理(Rogers et al.1988(参考文献(34))、Visser 1991(参考文献(38))、McCormick 1991(参考文献(29)))、Lindsey et al.1991(参考文献(28)))。从而，以农杆菌的菌系、载体类型、培养基组成、选择性标记基因和启动子类型以及组织材料的种类为中心开展了转基因系统的改良研究。
对此，基于这样一种考虑，在没有接种农杆菌之前使植物组织处于易进行转基因的生理状态，但是这项研究还没有人做。通过一种处理方式如果能改变其生理状态其利用价值是非常可观的，除了提高转基因效率外，还能够将以前很难实施的植物种类和基因类型经过转基因而获得显著的效果。关于对植物细胞进行预处理的研究，如粒子枪法(Bidney et al.，1992(参考文献(5)))及超声处理(Trick et al.，1997(参考文献(37)))。这种预处理的目的是为了通过物理性损伤植物组织使细菌进入组织细胞内，来增加植物细胞感染的数量。但是这种方法只不过比从前广泛使用的盘片法(Horsch et al.，1985(参考文献(17)))向前发展了一步，它并不是改进的新方法。另外该方法的效果和推广性至今还不清楚，它不能作为一般的方法来使用。
发明内容
因此，基于上述的技术背景，本发明所要解决的技术问题是提供一种提高植物细胞转基因效率的方法，该方法比从前的农杆菌法的转基因效率高并对组织没有伤害又很容易转导基因。
本发明人经过刻苦钻研终于完成了本发明任务，即在使用农杆菌属细菌转基因的方面，通过对用于转基因的植物细胞或植物组织进行离心处理，可以有效地提高转基因的效率。
也就是说，本发明提供一种通过离心处理植物细胞或植物组织来提高农杆菌属细菌介导的植物细胞转基因效率的方法。
本发明提供的提高植物细胞转基因效率的方法，要比从前农杆菌法的转基因效率高并对组织没有伤害又可简单转导基因。本发明方法既适用于单子叶植物又适用于双子叶植物。
图1表示本发明方法中优选使用的超二元载体pTOK233的构建方法。
图2表示本发明方法中优选使用的超二元载体pSB133的基因图。
图3表示农杆菌属细菌中2种主要载体系统即中间载体系统和二元载体系统的构建过程的模式图。
图4表示来源于农杆菌强病原性菌系A281的2种二元载体系统的模式图。
另外，在上述各图中，其符号意义表示如下virB 存在于根癌农杆菌A281上的Ti质粒pTiBo542致毒区中的virB基因virC 存在于根癌农杆菌A281上的Ti质粒pTiBo542致毒区中的virC基因virG 存在于根癌农杆菌A281上的Ti质粒pTiBo542致毒区中的virG基因BL 农杆菌属细菌T-DNA的左侧基本序列BR 农杆菌属细菌T-DNA的左侧基本序列TC 抗四环素药性基因SP 抗大观霉素药性基因IG 内含子GUS基因HPT 抗潮霉素药性基因K 限制酶Kpn I位点H 限制酶Hind III位点Ampr 抗氨苄青霉素药性基因BAR bar基因Pnos 胭脂碱合酶基因的启动子Tnos 胭脂碱合酶基因的终止子P35S CaMV 35S启动子COS，cos λ噬菌体COS位点ORI，ori CoIE1复制起始点NPI，NPTII 抗卡那霉素药性基因Vir 农杆菌属细菌Ti质粒的完整vir区域S Vir 强病原性农杆菌属细菌Ti质粒pTiBo542的完整vir区域s vir*Ti质粒pTiBo542vir区域的部分片断本发明的
具体实施方式
本发明方法在使用农杆菌属细菌介导转基因的同时还对转导基因的植物细胞或植物组织进行离心处理。植物细胞或植物组织经离心后，在通常的重力下可与农杆菌属细菌接触，也可以边离心边与农杆菌属细菌接触。优选植物细胞或植物组织经离心后在通常重力下与农杆菌属细菌接触。
根据植物种类的不同，选择不同离心条件，但通常离心速度的范围为100G-25万G，优选500G-20万G，更优选1000G-15万G。离心处理时间可根据离心速度及植物种类等适当地选择，但通常优选1秒钟以上。虽然没有离心的上限，但是通常以10分钟左右为宜。离心处理时间的选择应考虑，当加大离心速度时，所需时间极短，例如即使在1秒钟以下也可以提高转基因的效率。当减少离心速度时，由于延长离心时间也可以有效地提高转基因效率。在大多数情况下，特别优选离心处理条件为500G-20万G，更优选1000G-15万G，时间为1秒钟-2小时，对植物细胞或植物组织来说适宜的离心条件可以根据常规的实验进行设计。
本发明方法的特征为，使与农杆菌属细菌接触的植物细胞或植物组织作为离心处理的材料，或者边离心边与农杆菌属细菌接触，通过使用常规方法介导农杆菌属细菌进行转基因或其原有转基因法也是适用的。
在本领域通常广泛使用农杆菌属细菌介导的植物的转导基因或转基因法。
自古以来，人们已知根癌农杆菌在很多双子叶植物中引起冠瘿病(crown gall disease)，在七十年代，发现Ti质粒与病原性有关，发现Ti质粒中的一段致瘤基因T-DNA被整合至植物的染色体上。还得知在T-DNA上有诱发肿瘤所必需的与激素(细胞因子和植物生长激素)合成相关的基因，同时在植物中还发现了细菌基因。T-DNA的切除对植物的转导在Ti质粒上都需要致毒区域(vir区域)的基因群，由于T-DNA被切除而T-DNA两端都需要基本序列。其它农杆菌属细菌发根植物单胞菌的Ri质粒上也具有同样的系统(图3和图4)。
T-DNA通过农杆菌介导可以整合到植物染色体上，因此希望在T-DNA上插入所要的基因也能被整合到植物染色体上。但是Ti质粒是一个很大的分子，其分子量超过190kb以上，所以用标准的基因工程学技术很难将基因插入到质粒T-DNA之上。由此，本发明人开发了将外源基因插入T-DNA上的方法。
首先，从肿瘤Ti质粒T-DNA中切除并制备激素合成基因的disarm型菌系LBA4404(Hoekema et al.，1983(参考文献(12))、C58C1(pGV3850)(Zambryski et al.，1983(参考文献(40)，GV3Ti11SE(Fraley etal.，1985(参考文献(9))等(图3)。在这个菌系里开发了2种转导系统，它包括将所要的基因导入农杆菌Ti质粒T-DNA，或者将具有所要基因的T-DNA导入农杆菌。其中一个基因操作方法很容易地把所要的基因插入目的对象中，用大肠杆菌将可以复制的中间载体通过三亲杂交法(triparentalmating)(Ditta et al.，1980(参考文献(8)))的同源重组导入至农杆菌disarm型Ti质粒的T-DNA区域，把这中间载体称其为中间载体法(Fraleyet al.，1985(参考文献(9))；Fraley et al.，1983(参考文献(10))；Zambryski et al.，1983(参考文献(40))、特开昭59-140885号(EP116718))。另一个基因操作方法是基于被称为二元载体法(binary vector)(图3)，T-DNA整合至植物需要vir区域，但是由于它们的功能相同无须在同一质粒上(Hoekema et al.，1983)。在这个vir区域上有virA、virB、virC、virD、virE及virG(植物生物技术事典(エンタプライズ株式会社出版1989))，所说vir区域是指该区域包括全部的virA、virB、virC、virD、virE及virG。因此，二元载体把T-DNA整合至农杆菌和大肠杆菌里可复制的很小的质粒上，再把它导入农杆菌disarm型Ti质粒上。所述将二元载体导入至农杆菌可利用电穿孔法和三亲杂交法。二元载体包括pBIN19(Bevan，1984(参考文献(4)))，pBI121(Jefferson，1987(参考文献(19)))，pGA482(An et al.，1988(参考文献(2))，特开昭60-70080号(EP120516))等，再以这些二元载体为基础构建很多新的二元载体，并用于转基因植物。在Ri质粒系统中用同样的载体也构建了转导系统。
农杆菌A281(Watson et al.，1975(参考文献(39)))是超烈性病原性菌系(super-virulent)，其宿主范围很广，转基因效率也高于其它菌系(Hood et al.，1987(参考文献(13))；Komari，1989(参考文献(21)))。这种特性是由A281Ti的质粒pTiBo542表现出来的(Hood et al.，1984(参考文献(16)；Jin et al.，1987(参考文献(20)；Komari et al.，1986(参考文献(24)))。
迄今为止，用pTiBo542已开发了2个新系统。一个系统是使用具有pTiBo542这种disarm型Ti质粒的菌系EHA101(Hood et al.，1986)及EHA105(Hood et al.，1993)，把该菌系应用于上述二元载体系统，由此，可使转导能力强的体系进行各种植物的转基因。另一个体系是超二元载体(‘super-binary’vector)(Hiei et al.，1994(参考文献(11))；Ishidaet al.，1996(参考文献(18))；Komari et al.，1999(参考文献(26))；WO94/00977号、WO95/06722号)(图4)。该体系由两种质粒构成，其中选择一种作为超二元载体系统两种质粒构成包括vir区域(virA、virB、virC、virD、virE及virG(以下分别将它们称作“片断区域”))disarm型Ti质粒及T-DNA质粒。其中不同的是使用了包含T-DNA的质粒，即在二元载体vir片断区域中，至少有一个vir片断区域被除掉，把含有被除掉的vir区域的片断(其中至少优选包含virB或virG的片断，更优选包含virB和virG的片断)整合至超二元载体(Komari.1990a(参考文献(22))上。它们可通过三亲杂交法的同源重组(Komari et al，.1996(参考文献(25))把已经整合上的所要基因T-DNA导入超二元载体农杆菌上。现已弄清这个超二元载体系统与上述的其他各种载体系统相比在很多植物种类中具有高效的转基因效率(Hiei et al.，1994(参考文献(11))；Ishida et al.，1996(参考文献(18))；Komari.1990b(参考文献(23))；Li et al.，1996(参考文献(27))；Saito et al.，1992(参考文献(35)))。
在本发明中虽然对农杆菌属细菌的宿主不作特殊的限定，但优选使用根癌农杆菌(如，上述的根癌农杆菌LBA4404(Hoekema et al.，1983(参考文献(12)))及EHA101(Hood et al.，1986参考文献(15)))。
根据本发明的方法，如果是基于农杆菌属细菌病原性(vir)区域基因群表达的转基因体系，则可以获得明显的转基因效果。因此，对于上述任何载体系统中的中间载体、二元载体、超烈性病原性二元载体、超二元载体等均适用于本发明，并且能够达到本发明的效果。改变这些载体类型，使用不同的载体体系也会得到同样的效果(如，把农杆菌属细菌vir区域的一部分或全部切除，附加整合至质粒中，vir区域的部分或全部被切除后可以作为新的质粒被导入农杆菌里)。当然根据本发明方法可以提高野生型农杆菌属细菌中的野生型T-NDA区域的植物转基因效率，换句话说就是提高感染的效率。
将所要基因转移给植物，可以通过常规的方法整合至所述质粒T-DNA区域的限制酶位点上，或者在该质粒上，同时通过适当的选择性标记可以筛选出已经整合有抗卡那霉素、巴龙霉素等抗药性的基因等，所述药物为其它所用。大型的且具有很多限制位点的基因有时用常规的亚克隆方法未必能把所要的基因转移至T-DNA质粒上。在这种情况下，通过三亲杂交法就可在农杆菌属细菌细胞内进行同源重组而达到导入DNA的目的。
把质粒导入根癌农杆菌等农杆菌属细菌可以依据已有的方法进行，其方法包括所述的三亲杂交法和电穿孔法、电子注射法、PEG法等化学方法。
即将导入植物的基因与现有方法相同，基本上使基因处于T-DNA左右序列交接之间。但是由于质粒是环状的，所以交接序列数目可以为1个也可以为3个以上，当把多个基因排列在不同位置上时交接序列为3个以上。在农杆菌属细菌中可以把基因排列在Ti或Ri质粒上，也可以排列在其它的质粒上。同时也可以排列在多种质粒上。
利用农杆菌属细菌导入基因的方法可以使植物细胞或植物组织单独与农杆菌属细菌接触。例如制备农杆菌属细菌悬浮液，其浓度为106-1011细胞/ml，把植物细胞或植物组织浸于该悬浮液中3-10分钟左右，然后，在固体培养基上共培养数日。
对供于转基因的细胞或组织不作任何限定，它们可以是叶、根、茎及其它的部位，也可以是如愈伤组织一样分化的或未分化的胚等。植物种类也不作限定但优选被子植物，而被子植物即可以是双子叶植物也可以是单子叶植物。
如下面将要叙述的实施例所示，本发明的方法与从前的农杆菌法相比其转基因效率明显得到提高。
实施例下面，根据实施例详细地说明本发明，但本发明却不能限定后面将要叙述的实施例。
实施例1(1)农杆菌的菌系及质粒使用LBA4404(pBI 121)(pBI 121为购于美国Clontech公司的产品，(Jefferson RA 1987(参考文献(19)))、LBA4404(pIG121Hm)(Hiei，Y.etal.，1994(参考文献(11))、LBA4404(pTOK233)(Hiei，Y.et al.，1994(参考文献(11))及LBA4404(pSB133))(图2)作为农杆菌及其载体。
如下构建pSB133。用限制酶SaI I消化pGA482(An G et al.，1985(参考文献(3)))获得6.2kb的DNA片断，再用SaI I消化pSB11(Komari et al.，1996(参考文献(25))获得5.1kb的DNA片断，将两片断结合成质粒。然后把该质粒用限制酶EcoRI BgIII消化得到8.6DNA片断。对该DNA片断进行平滑处理，插入BgIII接头(TaKaRa)得到pSB27质粒。用限制酶Hind III消化该pSB27，用Hind III消化pIG221(Ohta S et al.，1990(参考文献(32))得到3.1kb 35s启动子，以及插入包含内显子的GUS基因片断，得到pSB33。把pSB33导入大肠杆菌菌株LE392后，根据三亲杂交法(Ditta Get al.，1980(参考文献(8))转导含有pSB1(Komari et al.，1996(参考文献(25)))的农杆菌LBA4404菌株。在农杆菌内通过pSB1和pSB33之间的同源重组而获得pSB133。在pBI 121的T-DNA区域上有由胭脂碱合酶基因(nos)的启动子调控的抗卡那霉素药性基因(npt II)和由花椰菜花叶病毒(CaMV)的35s启动子调控的GUS基因。在pIG121Hm及pTOK233的T-DNA区域上，有通过nos启动子调控的npt II基因和通过35s启动子调控的hpt基因、还有在35s启动子上由蓖麻过氧化氢酶基因内含子介导的GUS基因。在pSB133的T-DNA区域上有由nos启动子调控的npt II基因、由CaMV的35s启动子调控的并由蓖麻过氧化氢酶基因内含子介导的GUS基因(图2)。还有，pSB133及pTOK233是一种转基因能力很强的超二元载体(Komari，T.et al.，1999(参考文献(26)))。
(2)供试品种及供试组织作为供试品种使用日本水稻品种「越光」及「月之光」。开花第8-14天后除去未成熟种子的颖，用70％乙醇固定数秒钟，用含有Tween20的1％次氯酸钠溶液进行15分钟无菌处理。用无菌水溶液清洗数次，取1.5-2mm大小的未成熟胚以供试验。
(3)离心处理把未成熟水稻胚放入无菌水溶液的离心管里，使用微量高速离心机、大型离心机或超高速离心机，在760G-150,000G转速下离心。离心后把农杆菌接种于未成熟胚里。
(4)接种与其培养未成熟胚的接种与共培养的方法依据Hiei et al.(1994)(参考文献(26)。也就是说，离心后除去离心管内的无菌水溶液，加入农杆菌悬浮液，用涡流搅拌机搅拌5-30秒。在AB培养基(Chilton，M-D et al.，1974(参考文献(6)))上培养农杆菌3-10天，用铂片记录农杆菌的菌落，并悬浮于AA调整培养基(AA主要无机盐类、AA氨基酸及AA维生素类(Toriyama K.et al.，1985((参考文献(36))、MS微量盐(Murashige，T et al.，1962(参考文献(30))、1.0g/l酪蛋白氨基酸、100μM乙酰丁香酮、0.2M蔗糖、0.2M葡萄糖)来制备农杆菌悬浮液。室温下静置约5分钟，在共培养的培养基上接种。所述共培养基是将2N6-AS培养基(Hiei etal.(1994)(参考文献(11)))的无机盐类换成R2培养基(Ohira et al.1973(参考文献(31)))的组分。然而主要无机盐类(KNO3，KH2PO4，CaCl22H2O，MgSO47H2O)均以1/2的浓度加入培养基中。调整菌的接种浓度为1×108-1×109cfu/ml。共培养3-13天，对于部分未成熟的胚用X-Gluc处理并研究GUS的表达(Hiei et al.(1994)(参考文献(11))。即共培养处理后，把组织浸入含有0.1％的Triton X-100的0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)，在37℃下静置1小时。用磷酸缓冲液除去农杆菌后，再加入1.0mM 5-溴-4氯-3-吲哚-葡糖醛酸(X-gluc)及含有20％甲醇的磷酸缓冲液。在37℃下静置24个小时。用显微镜观察被染成蓝色的细胞组织。
(5)转基因细胞的筛选经过共培养后，把未成熟胚及愈伤组织转移至含有250mg/l羧苄青霉素及250mg/l头孢噻肟、200mg/l巴龙霉素或10-30mg/l潮霉素的第一次筛选培养基，30℃连续光照，培养1-2周。在第一次筛选培养基里，又在(Hieiet al.(1994)(参考文献(11))的2N6K培养基里加入30g/l的D-山梨糖醇(K培养基)。另外，把Hiei et al.(1994)(参考文献(11))的2N6培养基(N6的无机盐及维生素类(Chu C.C.1978(参考文献(7)))、1g/l酪蛋白氨基酸、2mg/l的2，4-D)中的(NH4)2SO4量设为232mg/l并添加含有氨基酸类的AA培养基(Toriyama et al.，1985(参考文献(36))用作试验(N培养基)。
把第一次筛选培养基上形成的愈伤组织转移至含有250mg/l头孢噻肟及250mg/l羧苄青霉素、200mg/l巴龙霉素或80mg/l潮霉素的第二次筛选培养基上，30℃连续光照，培养1-2周。在第二次筛选培养基里，又将(Hieiet al.(1994)(参考文献(11))N6-7培养基中的(NH4)2SO4量设为232mg/l并添加至含有氨基酸类的AA培养基(Toriyama et al.，1985((参考文献(36))。另外，在上述第一次和第二次筛选培养基中均含有巴龙霉素，在这两种培养基中使用了8g/l培养基固化剂。经二次筛选后分析了愈伤组织抗药性的出现频率。
(6)转导体的再分化把来自未成熟胚的盘片选择性抗药愈伤组织接种至含有250mg/l羧苄青霉素及250mg/l头孢噻肟、100mg/l巴龙霉素或50mg/l潮霉素的再分化培养基N6S3(Hiei et al.(1994)(参考文献(11)))。
(7)分析再分化个体GUS的表达在25℃连续光照下，再分化培养4-5周得到各种抗药性再分化植物的叶片，把该叶片如上述一样用X-Gluc处理，并分析GUS的表达(Hiei et al.(1994)(参考文献(11)))。把再分化个体转移至稀释500倍的Hyponex水溶液中，25℃连续光照下，育苗约2周后，再移至室温内的离心罐中。
(8)结果(i)离心效果的考察使用微量高速离心机、大型高速离心机以及超高速离心机分析未成熟水稻胚的离心效果，其结果是，从10KG到100KG范围的离心处理，其转基因效率得到提高(表1，2，3，6)。所处理的时间以10分钟效果最佳(表4，5)。在「越光」和「月之光」的品种里其GUS瞬间表达频率没有发现不同。结果表明，离心处理不仅提高了转基因效率而且促进了愈伤组织的诱导，因此离心处理预示着包括其他植物种类在内的有利于诱导组培中的愈伤组织及其增殖。
从表6上来看，使用250KG的超高速离心机，处理60分钟没有观察到「月之光」的未成熟胚愈伤组织的诱导。但是在110KG离心处理60分钟时却观察到愈伤组织的诱导，GUS的表达效率也很高。对于「越光」，使用250KG的超高速离心机，处理60分钟同样没有观察到未成熟胚愈伤组织的诱导。从以上结果可知，未成熟水稻胚的离心处理，其离心处理效果在5KG-200KG之间比较合适，从处理方法上来看，使用微量高速离心机及大型高速离心机时认为20KG、40KG比较合适。从表9，10，11的结果来看，表明不管超二元载体LBA4404(pSB133)转基因能力有多么高，通常在二元载体LBA4404(pIG121Hm)上使用未成熟胚通过20KG60分钟处理同样也能进行转基因。
(ii)离心处理和共培养的考察在表-7，8里，共培养3天，6天，13天在瞬时表达分析仪上显示了GUS高效表达。9天的共培养也比其它实验表现出GUS的更高效表达。目前正在第一次筛选培养基进行共培养(10ppm潮霉素、200ppm巴龙霉素)，对其设定时间不同的各种未成熟胚，在9天和13天共同区域上，与3天和6天共同区域上比较，表现出愈伤组织抗药性出现频率低的现象。
(iii)对离心转基因效率的研究目前，正在把如上所述培养的GUS阳性转导体(表4，5)各自地驯化培养。一部分的系统采集种子研究结实情况。其研究结果是，经过离心处理的转导体与未处理的转导体(「越光」、「月之光」)相比其形态及结实没有发现差异。
Hiei et al.(1994(参考文献(11)))曾报道以水稻愈伤组织为材料可以进行较高效率的转基因技术。Aldimita RR et al.1996(参考文献(1))报导了未成熟水稻胚的转基因的例子。为了更有效稳定地实施这些转基因技术，上面阐述的离心处理法是非常有效的。尤其是未成熟胚易受栽培环境的影响不宜得到适于转基因的未成熟胚，通过离心处理可以维持更稳定又高效的转基因效率。Hiei et al.(1994(参考文献(11)))提供了转基因效率非常高的载体即超二元载体，它可以使水稻的转基因效率提高。根据Aldimita et al.1996(参考文献(1))的报导，仅在试验阶段里使用超二元载体LBA4404(pTOK233)则可得到转导体。在本研究的离心处理法中，即使使用一般的二元载体它也可与超二元载体妣美，并达到高于报道的转基因效率。通过把超二元载体和离心处理法结合起来使用可以进一步提高转基因效率。我们预测通过离心处理法在迄今为止无法得到转导体的品系里同样也能够获得高效的转导体。
表1各种离心处理和共培养后的GUS表达结果(试验菌系LBA4404/pSB133)
离心处理时间10分，共培养时间3-5天，GUS阳性未成熟胚数/供试未成熟胚数括号内表示在盘片里其GUS表达区域的面积-无，+小++中+++大表2来自「越光」未成熟胚的抗巴龙霉素药性愈伤组织的出现频率(试验菌系LBA4404/pSB133)
出现愈伤组织抗药性的未成熟胚数/供试未成熟胚数，2次筛选结束时的调查结果离心处理时间10分，共培养时间3-5天表3来自「月之光」未成熟胚的抗巴龙霉素药性愈伤组织的出现频率(试验菌系LBA4404/pSB133)
出现愈伤组织抗药性的未成熟胚数/供试未成熟胚数，2次筛选结束时的调查结果离心处理时间10分，共培养时间3-5天表4离心处理和共培养后的GUS表达结果(品种名「越光」)
离心速度20,000G，供试品种「越光」，GUS阳性未成熟胚数/供试未熟胚数在盘片里GUS表达区域的面积，+小++中+++大表5离心时间和抗巴龙霉素药性愈伤组织的出现频率(品种名「越光」)
离心速度20,000G，共培养时间3-5天，2次筛选结束时的调查结果出现愈伤组织抗药性的未成熟胚数/供试未成熟胚数表6离心处理强度和共培养后的GUS表达(品种名「月之光」)
供试菌系LBA4404/pIG121Hm，离心处理时间60分1)微量高速离心机2)大型高速离心机3)超高速离心机盘片部位所占有的GUS表达区域的比率-无，±＜1/8+1/8-1/4++＞1/4表7离心处理以及共培养时间和共培养后的GUS表达(品种名「月之光」)
供试菌系LBA4404/pIG121Hm，1)微量高速离心机2)大型高速离心机针对各种转速离心处理时间为60分钟盘片所占有的GUS表达区域的比率-无，±＜1/8+1/8-1/4++＞1/4表8离心处理及共培养时间和共培养后的GUS表达(品种名「越光」)
供试菌系LBA4404/pIG121Hm，1)微量高速离心机2)大型高速离心机针对各种转速离心处理时间为60分钟盘片所占有的GUS表达区域的比率-无，±＜1/8+1/8-1/4++＞1/4表9LBA4404(pBI121)的转基因结果(品种名「月之光」)
离心处理20KG·60分钟共培养5天表10LBA4404(pIG121Hm)转基因结果(品种名「月之光」)
离心处理20KG·60分钟共培养5天表11LBA4404(pBI121)转基因结果(品种名「越光」)
离心处理时间20KG·60分钟共培养5天表12LBA4404(pSB133)转基因结果(品种名「越光」)
离心处理20KG·60分钟共培养5天实施例2将大小为1.2mm的未成熟玉米胚(A188品种，采自农林水产省生物资源研究所)进行无菌处理，解剖取出，用LS-inf液体培养基洗涤1次。在离心管里，加入含有未成熟胚和100μM乙酰丁香酮的LS-inf培养基2.0ml，约为1×109cfu/ml并悬浮根癌农杆菌LBA4404(pSB133)(Ishida etal.1996(参考文献(18)))的悬浮液，在40,000G，4℃条件下离心30分钟。对照组未成熟胚同前所述在细菌悬浮液中室温下静置30分钟。缓慢搅拌之后，接种至LS-AS培养基上使胚轴面接触培养基。接种离心后的未成熟胚其操作如下。把无菌的未成熟胚用LS-inf液体培养基洗涤1次之后，转移至含有相同液体培养基的离心管里，在4℃20KG或40KG的条件下离心1小时。对照样品在液体培养基中室温下静置1小时。然后除去液体培养基，把浓度约为1×109cfu/ml并悬浮于LBA4404(pSB133)的悬浮液加入离心管里，小心搅拌。室温下静置5分钟后，接种至含有10μM AgNO3的LS-AS培养基上使胚轴面接触培养基。25℃条件下避光共培养3天，然后，取部分未成熟胚，如实施例1所述用X-gluc分析GUS基因瞬时表达。上述培养基及培养法均依照Ishida，Y.et al.1996(参考文献(18))描述的方法。
已接种LBA4404(pSB131)的未成熟胚A188的GUS基因瞬时表达如表13所示。任一未成熟胚里均显示了GUS基因的表达，但是对于对照胚来说，发现经过离心处理的未成熟胚大多数都表现出广域的基因表达。与农杆菌一起离心，对离心后的农杆菌接种时发现由于离心处理转基因的区域扩大了。即使改变了离心强度和处理时间也比对照组表现出更广域的GUS基因表达。
以上结果表明，用选择培养基培养离心后的未成熟胚时，转基因效率比对照组高且有可能得到转基因植物。用从前的农杆菌法不能得到A188转化体而(Ishida，Y et al.1996(参考文献(18))报导通过离心处理能够得到玉米品种的转基因植物。
表13未成熟胚A188GUS基因的瞬时表达
对照组用1G处理试验1为在农杆菌共存下，离心处理。试验2为离心处理后进行了农杆菌的接种试验。
参考文献(1)Aldemita RR，Hodges TK(1996)Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties.Planta 199612-617(2)An，G.，Evert，P.R.，Mitra，A.and Ha，S.B.(1988)Binary vectors.In Gelvin，S.B.and Schilperoort，R.A.(eds.)，Plant Molecular Biology Manual A3.Kluwer Academic Press，Dordrecht，pp.1-19.
(3)An，G.，Watson，BD.，Stachel，S.，Gordon，MP.&Nester，EW.，(1985)New cloning vehicles for transformation of higher plants.EMBO J.，4277-288.
(4)Bevan，M.(1984)Binary Agrobacterium vectors for plant transformation.Nucleic Acids Res.，12，8711-8721.
(5)Bidney，D.，Scelonge，C.，Martich，J.，Burrus，M.，Sims，L.，and Huffmanm G.(1992)Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens.Plant Mol.Biol.，18.301-313.
(6)Chilton，M-D.，Currier，TC.Farrand，SK.Bendich，AJ.Gordon，MP.&Nester EW.(1974)Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8bacteriophage DNA not detected in crown gall tumers.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，713672-3676(7)Chu，C.C.，(1978)Proc.Symp.Plant Tissue Culture，Science Press Peking，pp.43-50(8)Ditta，G.，Stanfield，S.，Corbin，D.and Helinski，D.R.(1980)Broadhost range DNA cloning system for Gram-negative bacteriaConstructionof gene bank of Rhizobium meliloti.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，7347-7351.
(9)Fraley，R.T.，Rogers，S.G.，Horsch，R.B.，Eicholtz，D.A.and Flick，J.S.(1985)The SEV systema new disarmed Ti plasmid vector for plant transformation.Bio/technology，3，629-635.
(10)Fraley，R.T.，Rogers，S.G.，Horsch，R.B.，Sanders，P.R.，Flick，J.S.，Adams，S.P.，Bittner，M.L.，Brand，L.A.，Fink，C.L.，Fry，J.S.，Galluppi，G.R.，Goldberg，S.B.，Hoffmann，N.L.and Woo，S.C.(1983)Expressionof bacterial genes in plant cells.Proc Natl Acad Sci USA，80，4803-4807.
(11)Hiei，Y.，Ohta，S.，Komari，T.and Kumashiro，T.(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal，6，271-282.
(12)Hoekema，A.，Hirsch，P.R.，Hooykaas，P.J.J.and Schilperoort，R.A.(1983)A binary plant vector strategy based on separation of vir-and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid.Nature，303，179-180.
(13)Hood，E.E.，Fraley，R.T.and Chilton，M.-D.(1987)Virulence of Agrobacterium tumefaciens strain A281 on legumes.Plant Physiol，83，529-534.
(14)Hood，E.E.，Gelvin，S.B.，Melchers，L.S.and Hoekema，A.(1993)NewAgrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Res.，2，208-218.
(15)Hood，E.E.，Helmer，G.L.，Fraley，R.T.and Chilton，M.-D.(1986)The hypervirulence of Agrobacterium tumefaciens A281 is encoded in a region of pTiBo542 outside of T-DNA.J.Bacteriol.，168，1291-1301.
(16)Hood，E.E.，Jen，G.，Kayes，L.，Kramer，J.，Fraley，R.T.and Chilton，M.-D.(1984)Restriction endonuclease map of pTiBo542，a potential Ti-plasmid vector for genetic engineering of plants.Bio/technology，2，702-709.
(17)Horsch，R.B.，Fry，J.E.，Hoffmann，N.L.，Eichholtz，D.，Rpgers，S.G.and Fraley，R.T.(1985)A simple and general method for transferring genes into plants.Science 227，1229-1231.
(18)Ishida，Y.，Saito，H.，Ohta，S.，Hiei，Y.，Komari，T.and Kumashiro，T.(1996)High efficiency transformation of maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens.Nature Biotechnol，14，745-750.
(19)Jefferson，R.A.(1987)Assaying chimeric genes in plantsthe GUS gene fusion system.Plant Mol.Biol.Rep.，5，387-405.
(20)Jin，S.，Komari，T.，Gordon，M.P.and Nester，E.W.(1987)Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281.J.Bacteriol.，169，4417-4425.
(21)Komari，T.(1989)Transformation of callus cultures of nine plant species mediated by Agrobacterium.Plant Sci.，60，223-229.
(22)Komari，T.(1990a)Genetic characterization of double-flowered tobacco plant obtained in a transformation experiment.Theor.Appl.Genet.，80.167-171.
(23)Komari，T.(1990b)Transformation of cultured cells of Chenopodiumquinoa by binary vectors that carry a fragment of DNA from the virulenceregion of pTiBo542.Plant Cell Reports，9，303-306.
(24)Komari，T.，Halperin，W.and Nester，E.W.(1986)Physical and functional map of supervirulent Agrobacterium tumefaciens tumor-inducing plasmid pTiBo542.J.Bacteriol.，166，88-94.
(25)Komari，T.，Hiei，Y.，Saito，Y.，Murai，N.and Kumashiro，T.(1996)Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers.Plant J，10，165-174.
(26)Komari，T.and Kubo，T.(1999)Methods of Genetic TransformationAgrobacterium tumefaciens.In Vasil，I.K.(ed.)Molecular improvement ofcereal crops.Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，pp.43-82.
(27)Li，H.-Q.，Sautter，C.，Potrykus，I.and Puonti-Kaerlas，J.(1996)Genetic transformation of cassava(Manihot esculenta Crantz).Nature Biotechnol.，14，736-740.
(28)Lindsey，K.，Gallois，P.and Eady，C.(1991)Regeneration and transformation of sugarbeetby Agrobacterium tumefaciens.Plant Tissue Culture Manual B71-13.Kluwer Academic Publishers.
(29)McCormick，S.(1991)Transformation of tomato with Agrobacterium tumefaciens.Plant Tissue Culture Manual B61-9.Kluwer Academic Publishers.
(30)Murashige，T.and Skoog，F.(1962)Physiol.Plant 15473-497.
(31)Ohira，K.，Ojima，K.，Fujiwara，A.(1973)Studies on the nutritionof rice cell culture I.Asimple，defined medium for rapid growth in suspension culture.Plant Cell Physol.，141113-1121.
(32)Ohta，S.，Mita，S.，Hattori，T.，Namamura，K.(1990)Constructionand expression in tobacco of aβ-glucuronidase(GUS)reporter gene containing an intron within the coding sequence.Plant Cell Physiol.31805-813.
(33)Potrykus，I.，Bilang，R.，Futterer，J.，Sautter，C.and Schrott，M.(1998)Agricultural Biotecnology，NYMercel Dekker Inc.pp.119-159.
(34)Rogers，S.G.，Horsch，R.B.and Fraley，R.T.(1988)Gene transfer in plantsProduction of transformed plants using Ti plasmid vectors.Method for Plant Molecular Biology，CAAcademic Press Inc.pp.423-436.
(35)Saito，Y.，Komari，T.，Masuta，C.，Hayashi，Y.，Kumashiro，T.and Takanami，Y.(1992)Cucumber mosaic virus-tolerant transgenic tomato plants expressing a satellite RNA.Theor.Appl.Genet.，83，679-683.
(36)Toriyama，K.and Hinata，K.(1985)Plant Sci.41179-183(37)Trick，H.N.and Finer，J.J.(1997)SAATsonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation.Transgenic Research 6329-336.
(38)Visser，R.G.F.(1991)Regeneration and transformation of potato byAgrobacterium tumefaciens.Plant Tissue Culture Manual B51-9.Kluwer Academic Publishers.
(39)Watson，B.，Currier，T.C.，Gordon，M.P.，Chilton，M.-D.and Nester，E.W.(1975)Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens.J Bacteriol，123，255-264.
(40)Zambryski，P.，Joos，H.，Genetello，C.，Leemans，J.，Van Montagu，M.and Schell，J.(1983)Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of theirnormal regeneration capacity.EMBO J，2，2143-2150.
权利要求
1.一种农杆菌属细菌介导的植物细胞转基因的方法，其中通过对植物细胞或植物组织的离心处理，可提高植物细胞转基因的效率，其中离心处理是在1000G-100kG的离心速度范围内进行1秒至2小时。
2.权利要求
1所述的方法，其中植物细胞或植物组织经离心处理后，进行转基因。
3.权利要求
1至2中任一项所述的方法，其中所培育的植物细胞或植物组织来自于被子植物。
4.权利要求
1-3中所述的方法，其中所培育的植物细胞或植物组织来自于单子叶植物。
5.权利要求
4所述的方法，其中所培育的植物细胞或植物组织来自于禾本科植物。
6.权利要求
5所述的方法，其中所培育的植物细胞或植物组织来自于水稻或玉米。
7.一种培育植物的方法，其特征在于，使用权利要求
1至6所述的方法。
8.通过权利要求
1至7所述方法培育出的植物细胞或植物组织。
9.一种培育被子植物的方法，其特征在于，使用权利要求
3所述的方法。
10.通过权利要求
3或9所述方法培育出的被子植物细胞或被子植物组织。
11.一种培育单子叶植物的方法，其特征在于，使用权利要求
9所述的方法。
12.通过权利要求
4或11所述方法培育出的单子叶植物细胞或单子叶植物组织。
13.一种培育禾本科植物的方法，其特征在于，使用权利要求
4所述的方法。
14.通过权利要求
5或13所述方法培育出的禾本科植物细胞或禾本科植物组织。
15.一种培育水稻或玉米的方法，其特征在于，使用权利要求
6所述的方法。
16.通过权利要求
6或15所述方法培育的水稻细胞、水稻组织、玉米细胞或玉米组织。
专利摘要
公开一种提高植物细胞转基因效率的方法，该方法比从前的农杆菌法容易进行转基因且效率高并对细胞组织没有伤害。在本发明方法中，通过农杆菌属细菌转基因的同时经过对植物细胞或植物组织的离心处理，可提高植物细胞转基因效率。
文档编号C12N15/82GKCN1268752SQ00813814
公开日2006年8月9日 申请日期2000年8月3日
发明者樋江井佑弘, 笠冈启介, 石田佑二 申请人:日本烟草产业株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan