专利名称:利用家蚕生物反应器生产广适性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程，特指一种利用家蚕生物反应器生产广适性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法。
背景技术：
由于饲料中加入植酸酶，可减少无机磷酸盐加入量，提高畜牧业生产效益和降低磷对环境的污染。
虽然植酸酶具有良好的饲喂效果，但到目前为止还没有在饲料工业上得到广泛应用，其根本原因在于，在天然微生物中植酸酶的表达量太低，从而难以大量获得廉价的植酸酶产品，不能满足饲料工业发展的要求。随着生物技术、基因工程等高新技术的发展，利用生物反应器来高效表达植酸酶基因，提高植酸酶产量、降低生产成本已得到应用。几种微生物来源的植酸酶基因已得到了分离，如酵母Saccaromyces cerevisiae(Bajwa W.，Nucleic Acids Res.，127721-7739，1984)以及源自于大肠杆菌E.coli的同时具有植酸酶和酸性磷酸脂酶活力的双功酶appA(Dassa，J.，et al.Bacteriol.1725497-5500，1990)等。植酸酶基因表达的研究主要集中在来源于A.niger(ficuum)的植酸酶基因phyA和phyB上。但国内外的表达研究达到的表达水平都很低。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用杆状病毒表达系统，尤其是家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统高效表达、生产广适性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法，以期达到植酸酶的大量、廉价生产，在饲料及食品中广泛应用。
其目的是这样实现的
将植酸酶基因与杆状病毒载体进行重组；用重组病毒感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行广适性、高比活植酸酶表达；收集含广适性、高比活植酸酶的昆虫宿主。
所述的杆状病毒是BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、或TeNPV。
所述的昆虫宿主是家蚕、野蚕、蓖麻蚕、樟蚕、樗蚕、柞蚕、日本柞蚕、野天蚕、苜蓿尺蠖、茶尺蠖、甘兰夜蛾、秋粘虫、粉纹夜蛾、行军虫、棉铃虫、美国棉粘虫、烟青虫、烟草夜蛾、东方粘虫、或舞毒蛾。
所述的杆状病毒运载载体AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6.Bac to Pac，Bacmid，BlucBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，PAcAS3，pAcC129、C4、DZI，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcM4LF2、7、8，pAcMP1、2，pAcRP23、25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac1、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX 1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391、1392、1393、pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，或pUAC-5。
所述的重组病毒是通过口食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体。所述的蛹体为1-2天的早期嫩蛹。
本发明采用基因重组技术，将来源于各种微生物(如黑曲霉、烟曲霉、酵母等真菌，大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌等细菌)、植物(玉米、大豆、水稻等)的植酸酶基因构建到各种杆状病毒运载载体(如AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2、7、8，pAcMP1、2，pAcRP23、25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac1、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX 1.1，pSYN XIVVI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391、1392、1393，pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，pUAC-5)上，使广适性、高比活植酸酶基因在多角体启动子、p10启动子或别的病毒和真核生物的强启动子的控制之下，通过体内或体外(invivo/in vitro)重组，将广适性、高比活植酸酶基因appA整合到杆状病毒的基因组上，得到重组病毒。重组病毒可通过经口食下或采用各种手段透过表皮感染1-5龄(最优时间为四或五龄)的昆虫幼虫或蛹体(最优时间为1-2天的早期嫩蛹)，表达生产广适性、高比活植酸酶。
本发明中最优化的方案是将来源于大肠杆菌(E.coli)的植酸酶和酸性磷酸脂酶的双功酶基因appA，插入到运载载体pVL1393上，再通过体内重组将appA基因转移到家蚕杆状病毒亲本株BmNPV-ZJ8的基因组上，替代基因组上的Polyhedrin基因，通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带appA的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(appA)。将其感染家蚕细胞系或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，可大量繁殖rBmNPV(appA)。当rBmNPV(appA)在蚕体内复制时，appA在多角体蛋白基因(polh)启动子控制下表达，产生广适性、高比活植酸酶appA。在感染3-6天(最佳为5天)后收集含植酸酶的家蚕幼虫或蛹的体液(或整体匀浆)，杀灭感染性病原后，将其与载体(如麸皮、粕、石粉等)拌和，烘干、粉碎后便得到广适性、高比活植酸酶制剂，可做为饲料添加剂添加到单胃动物或鱼饲料中。在酸性或近于中性胃液中，广适性、高比活植酸酶水解植酸，将植酸磷降解为肌醇和磷酸。本发明生产的广适性、高比活植酸酶经过分离、纯化后，还可添加到食品中，促进食品中营养成分的吸收，提高食品的营养价值。
本发明采用杆状病毒表达系统，应用昆虫幼虫及蛹作为生物反应器大规模生产广适性、高比活植酸酶，可在单胃动物及鱼的饲料或食品中应用。本发明优化的杆状病毒表达系统为家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统，通过基因重组，将广适性、高比活植酸酶基因appA重组进家蚕杆状病毒BmNPV，获得重组家蚕杆状病毒rBmNPV(appA)，使携带广适性、高比活植酸酶基因的rBmNPV(appA)在不同发育阶段的家蚕(幼虫、蛹等)中繁殖，应用家蚕作为宿主的生物反应器生产植酸酶。同样，利用别的杆状病毒表达系统，如AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、TnNPV等也可按同样的方法表达生产广适性、高比活植酸酶。
本发明的优点在于将appA基因重组进家蚕杆状病毒，获得重组病毒rBmNPV(appA)，rBmNPV(appA)感染家蚕幼虫或蛹体后，appA基因得到高表达，每毫升蚕血淋巴可产生1.5毫克以上的appA蛋白，活力高达5000U以上，一条蚕(或蛹)产生的酶活力约为3万单位(或2万单位)以上。从大肠杆菌中克隆的appA基因曾在大肠杆菌表达系统(Golovan，S.，et al.，Can.J.Microbial.4659-71，2000)和毕赤酵母系统(Rodriguez E.，et al.，Arch.Biochem.Biophys.，382(1)105-112，2000)中进行了表达，但是表达量均很低，不足以大规模生产。而本发明的双功酶appA其植酸酶每毫克的活力达3000U以上，其比活力是中国专利公开号CN1184156A和中国专利申请号99103564.X的phyA2基因的30倍以上，pH适应性在1.2-6.5和温度在10-70℃范围内均有很高的活力，耐热性亦优于phyA2基因，便于酶制剂加工。缫丝厂的下脚蚕蛹一直是饲料的蛋白源，因此加入用本发明生产的植酸酶，同时也给饲料加入了蛋白，增加了饲料营养价值，且无需投资建厂，无三废，电力和水资源等能源消耗极少。除可用于工业化生产的配合饲料外，还可直接为农民使用于各种单胃畜禽动物(如猪、鸡等)和鱼中，因此符合我国国情，极有应用推广价值。由于家蚕已经我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以此种广适性、高比活植酸酶appA经部分纯化后，可作为食品添加剂，提高食品的营养价值。总体而言，本项发明可以大幅度降低植酸酶的生产成本，能产生良好的经济、生态和社会效益。
四.
图1、重组运载载体pVL1393(appA)的构建图2、重组运载载体pVL1393(appA)酶切鉴定图
Lane1pGEM-3Z(appA)/BamHI+EcoRI；Lane2pVL1393(appA)/BamHI+EcoRI；Lane3pVL1393(appA)/BamHI+EcoRI；Lane4λDNA/HindIII Marker图3、重组病毒rBmNPV(appA)的PCR鉴定Lane1pVL1393-appA质粒DNA为模板；Lane2rBmNPV(appA)病毒DNA为模板；Lane3筛选的大肠杆菌基因组DNA为模板；Lane4λDNA/HindIII Marker图4、appA基因在家蚕幼虫中的表达图5、appA基因在家蚕蛹中的表达图6、植酸酶的反应最适pH值图7、appA植酸酶的温度稳定性五.实施方式实验材料1.菌株、病毒株与载体大肠杆菌株E.coli TG1和DH5α购自Promega公司；运载载体pVL1393、家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株BmNPV-ZJ8由中国科学院上海生化所吴祥甫研究员惠赠；家蚕品种JY1由中国农业科学院蚕业研究所农业部家蚕生物技术重点开放实验室保存。
2.酶与试剂限制性内切酶、连接酶为Boehringer公司产品。
3.生化试剂IPTG、X-Gal、SDS及植酸钠为Sigma公司产品。过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。Lipofectin、低融点琼脂糖LMP、PCR试剂盒、T4DNA连接酶、RNA酶、Proteinase K、细胞培养基TC-100、胎牛血清及其他试剂购于GIBCO-BRL公司。
4.培养基大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；家蚕细胞培养基为TC-100。实施例一(一)、appA基因高表达大肠杆菌菌株的筛选1.采集样本(来源于农户散养、未喂配合饲料及添加剂的新鲜猪粪)。
2.称取0.05g样品，加入蒸馏水1ml，充分摇匀。
3.用蒸馏水稀释步骤2中样品1000倍。
4.倒平板，下层为不含抗生素的LB，上层为琼脂糖(1％agarose；100mM醋酸钠缓冲液，pH4.5；20mM植酸钠；50mM CaCl2)，取100μl稀释液涂布于平板上倒置培养过夜。
5.用灭菌牙签挑取单菌落于4ml LB液体培养基过夜培养。
6.离心菌液，弃上清。沉淀用1ml蒸馏水洗一次，充分混匀，再次离心去上清。
7.沉淀中加入250μl Solution I，摇匀后加入少许溶菌酶粉末，混匀，于37℃温育10分钟。
8.样品于冰上进行超声波破碎，强度为14，重复3次。
9.稀释20倍后取100μl于试管中，加入含植酸钠的缓冲液(内含4mM植酸钠，0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液，pH4.5)，于37℃水浴中反应30分钟。
10.加入1ml 10％TCA，终止反应。
11.加入2ml铁钼蓝显色剂，显色5分钟。
12.用紫外分光光度计在750nm波长处测定光密度值。将光密度值高的菌株用甘油保存于-20℃。
总共筛选了二百个菌株，最高和最低的菌株appA活力相差500倍以上，保留活力最好的菌株并制备相应的基因组DNA。(二)、appA基因的克隆和序列分析1.含appA基因高表达E.coli基因组DNA的制备(1)挑取单菌落，于37℃过夜培养。
(2)12000rpm离心2min，去上清。
(3)沉淀中加入567μl TE缓冲液，混匀重悬，加入30μl10％(W/V)SDS和3μl20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃温育1hr。
(4)加入100μl 5mol/l的NaCl，充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl(10％CTAB0.7mol/L NaCl)，混匀，于65℃温育10min。
(5)加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，11000g离心5min，上清移入新管。
(6)加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀，11000g离心5min，上清移入新管。
(7)加入等体积氯仿，混匀，11000g离心5min，上清移入新管。
(8)加入0.6体积异戊醇，轻轻混匀直到DNA沉淀，11000g离心5min，去上清。
(9)沉淀中加入1ml 70％酒精。
(10)11000g离心5min，去上清，抽干后加入50μl 0.1×TE溶解，于-20℃保存。2.PCR扩增appA基因产物化学合成appA基因5’端和3’端引物5’-GAG GAT CCA CGA TGA AAGCGA TCT TAA TCC CAT-3’(Forward)和5’-TTG AAT TCA TTA CAA ACT GCACGC CGG TAT-3’(Revise)。用制备的基因组DNA作为模板进行PCR反应，扩增appA基因。PCR反应体系如下表、1PCR反应条件加入物 体积灭菌ddH2O 33μl10×PCR Buffer 5μl2.5mM dNTP 4μl25mM MgCl23μl5‘引物 1μl3‘引物 1μl模板DNA 2μlTaq酶 1μlTotal 50μlPCR反应过程94℃变性10分钟；94℃ 1分钟，53℃ 1分30秒，72℃ 3分钟，共35个循环。最后延伸反应8分钟。3.PCR产物的纯化将PCR扩增的appA基因产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出约1.4kb的片段。在紫外灯下用灭菌手术刀切取含相应DNA片段的凝胶，然后用Geneclean试剂盒进行纯化。方法如下切取凝胶片段并称重，将其放入灭菌的1.5ml小离心管中，加入3倍(v/w)体积的6M NaI，37℃将凝胶溶解后，加入10μl玻璃奶(Glass milk)，混匀后室温下放置5分钟，使DNA充分吸附在玻璃奶上，12000rpm离心5秒钟，再用New Wash溶液洗三次，每次均将沉淀弹起，并离心。最后将沉淀晾干后加入30μl 0.1×TE Buffer溶解DNA，离心后去沉淀，取上清作进一步分析。4.酶切与连接反应酶切反应纯化后DNA用BamHI和EcoRI双酶切分析，反应总体积为50μl，其中纯化的PCR产物10μl，10×酶相应缓冲液5μl，两种酶各为1μl，无菌水补足体积。37℃反应2小时以上。将转移质粒pGEM-3Z作同样酶切反应。反应结束后于65℃灭活10分钟。
连接反应连接总体积15μl，PCR产物8μl，载体1μl，5×T4 DNA连接缓冲液3μl，T4 DNA连接酶1μl，无菌水补足体积，12～14℃连接过夜。5.大肠杆菌的遗传转化用75mM CaCl2制备大肠杆菌TG1感受态细胞。取步骤4中制备的连接混合物5μl，加到200μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃热激2分钟，迅速置于冰上1～2分钟，加入已温育至37℃的LB培养基500μl，37℃培养1小时，取100～200μl涂布于含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。6.质粒DNA的制备(1)从转化的LB平板上挑取单个菌落，接种于3ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，37℃培养过夜。
(2)取1.5ml菌液于小离心管中，3500rpm离心4min，去上清。
(3)加入Solution I 150μl，混匀后置于冰上15min。
(4)加入Solution II 300μl，氯仿150μl，轻轻混匀后静置5min。
(5)加入Solution III 450μl，混匀后置于冰上15min。
(6)11000g离心10min，上清移入新管。
(7)加入异丙醇450μl，混匀后置于4℃ 15min。
(8)11000g离心6min，去上清。
(9)加入TER250μl，混匀后置于37℃ 20min。
(10)加入PPt Buffer 300～350μl，混匀后静置15min。
(11)11000g离心6min，去上清。
(12)加入75％乙醇400μl。
(13)11000g离心3min，倒掉乙醇，抽干后加入0.1×TE Buffer 40μl溶解，于-20℃保存。7.重组子的鉴定用BamHI和EcoRI双酶切步骤6中制备的质粒DNA，电泳后出现约1.4kb的DNA条带的质粒为重组运载质粒。将重组质粒pGEM-3Z(appA)进行双向测序。appA基因序列及氨基酸序列分别见表2、表3。(4)、转移载体pVL1393(appA)的构建将制备的质粒pGEM-3Z(appA)用BamHI和EcoRI双酶切，按上述方法纯化appA基因片段，与经同样酶切的杆状病毒转移载体pVL1393连接后转化大肠杆菌TG1，筛选得到重组转移载体pVL1393-appA。重组质粒构建如图1所示，酶切鉴定图谱如图2所示。(5)、家蚕核多角体病毒亲本株BmNPV-ZJ8的繁殖及病毒DNA的制备按GIBCO公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2N NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞Bm-5。用家蚕核多角体病毒亲本株BmNPV-ZJ8感染对数生长期的细胞约50ml，感染复数为1，3～4天后收集病毒感染液，离心(5000rpm×10min)，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1000ml中含Tris 12.1g，EDTA33.6g，KCl 14.1g，pH7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等体积的苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μl TE Buffer中，放4℃保存备用。(6)、重组家蚕杆状病毒rBmNPV(appA)的构建和获得1.重组杆状病毒rBmNPV(appA)的构建接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmNPV-ZJ8 DNA，2μg重组转移质粒pVL1393-appA DNA和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒的筛选。2.重组家蚕杆状病毒rBmNPV(appA)的筛选和纯化接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1小时后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(appA)。3.重组病毒rBmNPV(appA)在家蚕细胞中的扩增将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(appA)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(appA)。4.重组病毒的鉴定利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下取病毒上清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为5’-GAGGATCCACGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT5’-TTGAATTCATTACAAACTGCACGCCGGTAT取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应条件为94℃变性5min、94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 1min，30个循环，最后72℃延伸5min。取15μl反应产物电泳分析，结果见图3。(7)、appA基因在家蚕中的表达本实验所用的家蚕高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的15头家蚕为一组，每头蚕接种约1.0×105rBmNPV(appA)，即5μl接种液中含2.0×107pfu/ml的rBmNPV(appA)，共12组，在病毒感染后分别按60h、72h、84h、96h、108h、120h的时间取血样并测定appA酶活力，重复三次。结果由图4所示，从感染病毒60h开始，appA开始表达，随着时间的增加，所表达的酶活也随之增加，在病毒感染后108小时达最高，每ml蚕血淋巴appA酶活力达4876.35单位，随后酶活开始下降。实施例二、appA基因在家蚕蛹体中表达本实施例所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后选择平均体重相同的15粒蚕蛹为一组，每头蛹接种约1.0×105rBmNPV(appA)，即5μl接种液中含2.0×107pfu/ml的rBmNPV(appA)，共12组，在病毒感染后按60h、72h、84h、96h、108h、120h的时间取血样并测定appA酶活力，重复三次。结果如图5所示，从感染病毒60h开始，appA开始表达，随着时间的增加，所表达的酶活也随之增加，在病毒感染后96至108小时达最高，每ml蚕血淋巴appA酶活力大于5000单位，随后酶活开始下降。家蚕生产的广适性、高比活植酸酶的特性分析如下1.植酸酶的反应最适pH值分别用不同缓冲液配制底物，调节底物pH值，0.25mol/L Gly-HCl(pH1.2-4)、0.25mol/L NaAc-HAc(pH4-6)、0.25mol/L Tris-HCl(pH6-7)、0.1mol/L Tris-HCl(pH6-9)，测定酶在37℃时不同pH条件下反应30分钟的酶活力，结果如图6所示，appA植酸酶催化反应的最适pH为4.5，当pH值超过5时，酶活力急剧下降，在pH值超过7.5时，酶活力几乎测不出。2.appA植酸酶的温度稳定性含appA植酸酶的血样用0.1mol/L NaAc-HAc缓冲液(pH4.5)、0.15 mol/L HCl、1mmol/L CaCl2，5×稀释后，分别在30-95℃下水浴15分钟，迅速用冰浴降温，10000rpm×20min离心，取上清稀释后测定酶活力，以稀释后未经处理的样品作对照，比较酶活力。结果如图7所示，appA植酸酶活力在温度20-60℃之间随温度的上升而增强，至60℃时达最大，此后随温度的下降而降低，当温度超过90℃后酶已经完全失活。
表2 appA基因序列1 GGA TCC ACG ATG AAA GCG ATC TTA ATC CCA TTT TTA TCT CTT CTG 4546 ATT CCG TTA ACC CCG CAA TCT GCA TTC GCT CAG AGT GAG CCG GAG 9091 CTG AAG CTG GAA AGT GTG GTG ATT GTC AGT CGT CAT GGT GTG CGT 135136 GCT CCA ACC AAG GCC ACG CAA CTG ATG CAG GAT GTC ACC CCA GAC 180181 GCA TGG CCA ACC TGG CCG GTA AAA CTG GGT TGG CTG ACA CCG CGC 225226 GGT GGT GAG CTA ATC GCC TAT CTC GGA CAT TAC CAA CGC CAG CGT 270271 CTG GTA GCC GAC GGA TTG CTG GCG AAA AAG GGC TGC CCG CAG TCT 315316 GGT CAG GTC GCG ATT ATT GCT GAT GTC GAC GAG CGT ACC CGT AAA 360361 ACA GGC GAA GCC TTC GCC GCC GGG CTG GCA CCT GAC TGT GCA ATA 405406 ACC GTA CAT ACC CAG GCA GAT ACG TCC AGT CCC GAT CCG TTA TTT 450451 AAT CCT CTA AAA ACT GGC GTT TGC CAA CTG GAT AAC GCG AAC GTG 495496 ACT GAC GCG ATC CTC AGC AGG GCA GGA GGG TCA ATT GCT GAT TTT 540541 ACC GGG CAT CGG CAA ACG GCG TTT CGC GAA CTG GAA CGG GTG CTT 585586 AAT TTT CCG CAA TCA AAC TTG TGC CTT AAA CGT GAG AAA CAG GAC 630631 GAA AGC TCT TCA TTA ACG CAG GCA TTA CCA TCG GAA CTC AAG GTG 675676 AGC GCC GAC AAT GTC TCA TTA ACC GGT GCG GTA AGC CTC GCA TCA 720721 ATG CTG ACG GAG ATA TTT CTC CTG CAA CAA GCA CAG GGA ATG CCG 765766 GAG CCG GGG TGG GGA AGG ATC ACC GAT TCA CAC CAG TGG AAC ACC 810811 TTG CTA AGT TTG CAT AAC GCG CAA TTT TAT TTG CTA CAA CGC ACG 855856 CCA GAG GTT GCC CGC AGC CGC GCC ACC CCG TTA TTA GAT TTG ATC 900901 AAG ACA GCG TTG ACG CCC CAT CCA CCG CAA AAA CAG GCG TAT GGT 945946 GTG ACA TTA CCC ACT TCA GTG CTG TTT ATC GCC GGA CAC GAT ACT 990991 AAT CTG GCA AAT GTC GGC GGC GCA CTG GAG CTC AAC TGG ACG CTC 10351036 CCC GGT CAG CCG GAT AAC ACG CCG CCA GGT GGT GAA CTG GTG TTT 10801081 GAA CGC TGG CGT CGG CTA AGC GAT AAC AGC CAG TGG ATT CAG GTT 11251126 TCG CTG GTC TTC CAG ACT TTA CAG CAG ATG CGT CAT AAA ACG CCG 11701171 CTG TCA TTA AAT ACG CCG CCC GGA GAG GTG AAA CTG ACC CTG GCA 12151216 GGA TGT GAA GAG CGA AAT GCG CAG GGC ATG TGT TCG TTG GCA GGT 12601261 TTT ACG CAA ATC GTG AAT GAA GCA CGC ATA CCG GCG TGC AGT TTG 13051306 TAA TGA ATT C 1350
表3 氨基酸序列表MKAILIPFLSLLIPLTPQSAFAQSEPELKLESVVIVSRHGVRAPTKATQLMQDVTPDAWPTWPVKLGWLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVADGLLAKKGCPQSGQVAIIADVDERTRKTGEAFAAGLAPDCAITVHTQADTSSPDPLFNPLKTGVCQLDNANVTDAILSRAGGSIADFTGHRQTAFRELERVLNFPQSNLCLKREKQDESSSLCQALPSELKVSADNVSLTGAVSLASMLTEIFKLQQAQGMPEPGWGRITDSHQWNTLLSLHNAQFYLLQRLPEVARSRATPLLDLIKTALTPHPPQKQAYGVTLPTSVLFIAGHDTNLANLGGALELNWTLPGQPDNTPPGGELVFERWRRLSDNSQWIQVSLVFQTLQQMRHKTPLSLNTPPGEVKLTLAGCEERNAQGMCSLAGFTQIVNEARIPACSL.
权利要求
1.一种利用家蚕生物反应器生产广适性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法，包括将植酸酶基因与杆状病毒载体进行重组；用重组病毒载体感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行广适性、高比活植酸酶表达；收集含广适性、高比活植酸酶的昆虫宿主。
2.按照权利要求
1所述的利用家蚕生物反应器生产广适性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法，其特征在于，所述的杆状病毒是BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、或TeNPV。
3.按照权利要求
1所述的利用家蚕生物反应器生产广适性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法，其特征在于，所述的昆虫宿主是家蚕、野蚕、蓖麻蚕、樟蚕、樗蚕、柞蚕、日本柞蚕、野天蚕、苜蓿尺蠖、茶尺蠖、甘兰夜蛾、秋粘虫、粉纹夜蛾、行军虫、棉铃虫、美国棉粘虫、烟青虫、烟草夜蛾、东方粘虫、或舞毒蛾。
4.按照权利要求
1所述的利用家蚕生物反应器生产广适性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法，其特征在于，所述的昆虫是家蚕，所述的杆状病毒是家蚕杆状病毒。
5.按照权利要求
1所述的利用家蚕生物反应器生产广适性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法，其特征在于，所述的杆状病毒运载载体AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUWl-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlucBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，PAcAS3，pAcC129、C4、DZI，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2、7、8，pAcMPl、2，pAcRP23、25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYMl，pAcJcC5，pBac1、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhel，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAKl，pPBac，pSHONEX 1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391、1392、1393、pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，或pUAC-5。
6.按照权利要求
1所述的利用家蚕生物反应器生产广适性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法，其特征在于，所述的重组病毒是经口或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体。
7.按照权利要求
1所述的利用家蚕生物反应器生产广适性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法，其特征在于，所述的蛹体为化蛹后1-2天的早期嫩蛹。
8.按照权利要求
1所述的利用家蚕生物反应器生产广适性、高比活植酸酶和酸性磷酸脂酶的方法，其特征在于，所述的植酸酶基因是来源于大肠杆菌的广适性、高比活植酸酶基因和酸性磷酸脂酶双功能基因appA；所述的运载载体是pVL1393；所述的重组是指将广适性、高比活植酸酶基因appA移到家蚕杆状病毒亲本株BmNPV-ZJ8的基因组上，替代病毒基因组上的Polyhedrin基因，然后通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带appA的重组家蚕杆状病毒rBmNPVappA；所述感染是将得到的重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹；在感染3-6天后收集含植酸酶的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆。
专利摘要
本发明提供一种利用重组杆状病毒在昆虫体内表达、生产广适性、高比活植酸酶appA方法，包括广适性、高比活植酸酶基因与杆状病毒载体进行重组；用重组病毒感染昆虫宿主；被感染的昆虫宿主进行植酸酶和酸性磷酸脂酶的表达；收集含植酸酶的家蚕幼虫或蛹的体液或匀浆。通过这种方法可以大量、廉价地生产广适性、高比活植酸酶appA和磷酸脂酶用作饲料添加剂。
文档编号C12N7/01GKCN1410540SQ01127288
公开日2003年4月16日 申请日期2001年9月29日
发明者张志芳, 何家禄, 姚斌, 周亚竟, 陈寅, 易咏竹 申请人:中国农业科学院蚕业研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan