专利名称:中国冬虫夏草真菌及其人工培养方法
本发明的目的在于解决中国冬虫夏草的人工培养问题。
中国冬虫夏草(Cordyceps Sinensis〔Berk〕Sacc)是一种名贵的野生药用和食用菌类植物。它的纯培养真菌从未被真正的分离到。本发明得到的这一微生物新种的分生孢子世代分类上属半知菌纲(Fungi Impergecti)从梗孢目(Moniliales)、从梗孢科(Moniliaceae)、头孢子菌属(Cephalosporium)定名为冬虫夏草头孢菌”学名Cephalospores Dongchongxiacae SP.nev冬虫夏草属(Cordyceps)在全世界已发现並鉴定的种有三百多个，但对生长在青藏高原的中国冬虫夏草虽在一百多年前就被命名为C.Sinensis(Berk)Sacc，但其真菌因未被真正分离倒，使其分生子世代(无性世代)的分类地位一直没有得到解决。国内外的许多研究都把分离到的杂菌或冬虫夏草属的其它种，误认为是中国冬虫夏草真菌。本发明澄清了这一错误。
本发明在获得真正的中国冬虫夏草的同时，研究出了它的人工培养方法。
其菌种的分离有两种方法一是组织分离法采集未成熟的新鲜冬虫夏草(最好是子座还未长出地面的)，洗净，用无菌水多次冲洗，放入0.1%升汞溶液中消毒5分钟，用灭菌蒸溜水洗去升汞，在无菌条件下，切去外皮，避开肠道，切取白净组织，剪碎，接于分离培养基表面，置于5～20℃温度条件下培养，此法简单易行，如材料不理想，培养温度不适宜或消毒不彻底，容易长出其它共生菌或互生菌。
一种是子囊孢子培养法将尚未成熟的野生天然虫草移栽到有保护条件圃中，用消毒纸袋套在它的子座上，使弹出的子囊孢子附着在纸袋上，收取纸袋阴干，放在冰箱中备用。净化时将附有子囊孢子的纸袋浸于土壤浸出液中，浸透后用小刀将子囊孢子刮下，收集于离心管中，离心分离，弃去上部清液，用土壤浸出液反复洗涤，再用蔗糖溶液洗涤，反复离心分离，收集浮于液面的子囊孢子，再用土壤浸出液洗涤，放入冰箱中备用。萌发时取净化的子囊孢子少许，放入含庆大霉素的土壤浸出液中，室温培养三到六天，子囊孢子即可萌发，用灭菌吸管吸取已萌发的子囊孢子稀悬液，滴在琼脂平板上，在显微镜下挑取单个萌发孢子，接种在分离培养基上室温培养，此法麻烦，初生长缓慢，但可靠性高。
上述两种方法使用的分离培养基最好的配方是葡萄糖50克、水解乳蛋白10克、酵母膏1克，硫酸鎂0.5克、磷酸二氢钾1克，维生素液20毫升、琼脂20克、蒸溜水1000毫升，最好再加20%虫草蝙蝠蛾幼虫浸出液。
新鲜组织块培养接种一周后，周围长出细小菌丝，两个月后形成菌落三到四个月菌落直径可达1～2厘米，净化子囊孢子培养接种10天后，孢子芽管伸长、分枝，形成菌丝，两个月菌落直径2～6毫米，三个月可见很短的灰白色气中菌丝，四个月菌落直径达1～2厘米，並有棕黑色色素扩散于培养基中。
将上述方法获得的虫草真菌，接种于特殊培养基上(编号为S31)培养基配方为肉水500毫升、水解乳蛋白5克、酵母1克、葡萄糖30克、磷酸氢二钾1克、硫酸鎂0.2克、琼脂18克、核酸0.5克牛奶200毫升、蒸溜水400毫升，5～20℃温箱中培养一段时间长好后，移入5℃左右冰箱中，四个月后可看到小子座长出，移出室温培养一、二个月后小子座可长到2～3厘米，颜色、形态与天然虫草子座基本一样。将上述培养出的子座，用黑光灯照射，弹射出的子囊孢子的形态，大小与天然虫草的子囊孢子完全一样。
还可采用液体发酵方法加快菌丝的培养，其液体培养基有蚕蛹培养基(蚕蛹粉、葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸氢二钾和水);肝汤培养基(肝汤、洋芋汤、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸鎂、复合维生素B和水)等。获得的人工虫草菌丝经药理药化对比试验和天然虫草基本一样。
中国冬虫夏草真菌菌种的鉴别，可从菌落形态、培养基和基中菌丝颜色，分生孢子的形态、颜色、大小等方面观察，在不同培养基中菌丝形态不同，一种短小，分枝较小;一种为绒毛状，有较长的白色菌丝，呈不规则的树枝状，它们形成的菌落凸起，最初表面平滑坚硬，后变皱折不平，颜色从灰白转向棕色，气中菌丝极短，基中菌丝棕黑色，並有棕黑色素在培养基中扩散，而其它杂菌底色多数为黄色、红色或无色，菌丝在两个月以上长出分生孢子，单生无色，或双生、数个直至十多个呈头状生长，分生孢子是椭园形，其梗往往呈直角或锐角生长在菌丝上，呈细长瓶状，一般不分枝，也有少数2～5个分枝。
上述方法的一个实例是从化隆县挖来的新鲜虫草一株，洗净，用无菌水反复冲洗，放入0.1%的升汞液中消毒5分钟，用无菌水洗去升汞，在无菌条件下，切取内部白色组织。剪碎。接种在分离培养基表面，放在5～20℃温箱中一周后长出了菌丝，两个月后形成凸起硬壳的菌落。经扩大繁殖培养后将其移入前述编号为S31生长子座的培养基上继续培养，先在5～20℃温箱中培养一个月，然后移入5℃左右冰箱中，四个月后开始有尖细的子座长出。再移到有散射阳光的实验台上继续培养，一两个月后，子座可达2～3厘米长，颜色、形态与天然虫草的子座基本一样，将成熟的子座用20瓦黑光灯间歇照射，个别子座弹射出了子囊孢子，经鉴别，其形态、大小与天然生长的完全一样。
权利要求
1.中国冬虫夏草(简称虫草)是一种药用和食用的珍贵的菌类植物，目前世界上发现並鉴定的虫草真菌有三百多个种。中国冬虫夏草真菌是上述三百多个种其中的一个种，为头孢菌属，其特征在于它是以天然虫草组织或孢子为接种材料，在培养基中培养出来的虫草真菌。
2.如权利要求
1所述的虫草真菌，其特征在于真菌菌丝在不同培养基中的形态不同，一种短小、分枝较少;一种为绒毛状，有较长白色菌丝，有隔呈不规则的树枝状。形成的菌落凸起，最初表面平滑坚硬，后变皱折不平，颜色从灰白转向棕色，並有棕黑色素的扩散。
3.如权利要求
1或2所述的虫草真菌，其特征在于真菌菌丝两个月以上长出分生孢子，单生无色或双生、数个直至十多个呈头状生长，为长园形，其柄不规则的生长在菌丝上，呈细长瓶状，一般不分枝，也有少数2～5个分枝。
4.虫草属的其他种，目前已有将其菌接种于糖类、蛋白质、维生素、核酸等並添加谷物为基质的培养基中进行培养，然后将固体培养基上生长出来的菌丝移入糖类，蛋白质、维生素、核酸等並添加氨基酸以水为基质的液体培养基中，继续培养，形成菌座的人工培养方法。中国冬虫夏草真菌的人工培养方法，其特征在于以天然虫草组织或孢子为材料，接种于葡萄糖、蛋白胨为主的分离培养基上，温度在5～～20℃范围内，培养一～二个月，将纯分离物转接入特殊培养基中，仍在5～20℃条件下继续培养一段时间，然后移入5℃左右的冰箱中，四个月后有子座原基形成待长到1～2厘米后，再移到有散射阳光的室温下继续培养一～两个月，长成与天然虫草形态，颜色一样的子座。
5.如权利要求
4所述虫草真菌的人工培养方法，其特征在于分离培养基的最佳配方是葡萄糖50克、水解乳蛋白10克、酵母膏1克、硫酸鎂0.5克、磷酸二氢钾1克、维生素20毫升、琼脂20克、蒸溜水1000毫升、虫草蝙蝠蛾幼虫浸出液若干。
6.如权利要求
4所述虫草真菌的人工培养方法，其特征在于特殊培养基的配方是肉水500毫升、水解乳蛋白5克、酵母膏1克、葡萄糖30克、磷酸二氢钾1克、硫酸鎂0.2克、琼脂18克、核酸0.5克、牛奶200毫升、蒸溜水400毫升。
专利摘要
中国冬虫夏草是一种珍贵的野生药用和食用菌类植物。本发明从野生天然虫草上采用组织培养和子囊孢子培养的不同方法，获得与天然虫草性质形状一样的虫草真菌。在无菌器皿中人工培养，能长出与天然虫草一样的子座及与天然虫草完全一样的子囊孢子。从而证实分离到的是真正的中国冬虫夏草C.Sinensis真菌。人工虫草菌丝经药理药化对比试验与天然虫草基本一样，为人工培育和广泛应用提供了有效的方法。
文档编号C12N3/00GK85101971SQ85101971
公开日1987年3月4日 申请日期1985年4月1日
发明者沈南英, 张生民, 曾璐, 张显耻, 魏世录 申请人:青海省畜牧兽医科学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan