一种从组分iv-2沉淀中提取人血白蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种从组分IV-2沉淀中提取人血白蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]白蛋白(albumin)是人血浆中含量最多的蛋白质，约45g/L，占血浆总蛋白的60 %，是临床上常用的血容量扩张剂之一，血浆白蛋白主要有两方面生理功能:①维持血浆胶体渗透压，②与各种配体(ligands)结合，起运输功能。
[0003]人血白蛋白分离工艺是由美国哈佛大学cohn教授研宄开发的一种低温乙醇血浆分级技术，该技术通过多步调节低温乙醇法的五大要素:PH值、温度、乙醇浓度、蛋白浓度、离子强度来实现逐级分离血浆中的各种蛋白质，分离人血白蛋白的步骤分别为:组分I沉淀分离；组分11+111(或组分I+II+III)沉淀分离；组分IV-1沉淀分离；组分IV-2沉淀分离；组分V沉淀分离；组分V沉淀经过进一步纯化得到最终产物人血白蛋白。上述步骤中分离出的组分IV-2沉淀，通常作为废料经高压灭菌后废弃，由于分离沉淀的过程中，影响的因素很多，有一定量的白蛋白共沉于组分IV-2沉淀中而被一起废弃，造成浪费，而目前白蛋白市场也存在长期供需紧张的局面。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种可节约成本、避免浪费的
[0005]从组分IV-2沉淀中提取人血白蛋白的方法。
[0006]本发明提供了一种从组分IV-2沉淀中提取人血白蛋白的方法，包括以下步骤:
[0007]步骤一:溶解组分IV-2沉淀
[0008]将组分IV-2沉淀用含氯化钠和枸橼酸钠的水溶液完全溶解；
[0009]步骤二:分离组分IV-1沉淀
[0010]用醋酸-醋酸钠缓冲液调节步骤一的组分IV-2沉淀的溶解液pH值至6.00?
6.30，将温度降至-1.0?0.(TC，用乙醇调节乙醇终浓度至39?41%，用醋酸-醋酸钠缓冲液或氢氧化钠溶液调整PH值至6.00?6.30，调节悬液温度至-6.0°C?_4.0°C，搅拌均匀，开始悬液压滤，控制过滤压力为O?0.3MPa，过滤速度为20?90kg/min，滤出液温度为-5.5?-3.50C，悬液压完后清洗回收，回收液并入上清液罐，收集组分IV-1上清液，组分IV-1沉淀高压灭菌后废弃；
[0011 ] 步骤三:分离组分IV-2沉淀
[0012]用醋酸-醋酸钠缓冲液调节组分IV-1上清液pH值至5.70?5.90，用乙醇调节乙醇终浓度至41.5?42.5%，再用醋酸-醋酸钠缓冲液或氢氧化钠溶液调整pH值至
5.70?5.90，调节反应温度至-7.0°C?-5.0°C，搅拌反应完全后按每100kg制品加入硅藻土 2.0?3.0kg和珍珠岩2.0?3.0kg，搅拌反应，开始悬液压滤，控制过滤压力为O?0.3MPa，过滤速度为20?90kg/min，滤出液温度为-6.0?-4.0°C，悬液压完后进行清洗回收，回收液并入压滤上清液罐，收集组分IV-2上清液，组分IV-2沉淀高压灭菌废弃；
[0013]步骤四:分离组分V沉淀
[0014]用醋酸和乙醇混合液调节组分IV-2上清液的pH值至4.70?4.90，调节温度至-9.0?-8.00C，搅拌使其反应，开始悬液压滤，控制过滤压力为O?0.3MPa，过滤速度为20?90kg/min，滤出液温度为-8.5?-6.5°C，待悬液全部压滤完后，收集组分V沉淀；
[0015]步骤五:组分V沉淀溶解、过滤
[0016]将收集的组分V沉淀用沉淀重量5?7倍的0.0?4.(TC的注射用水溶解，搅拌至沉淀完全溶解，用醋酸-醋酸钠缓冲液调整PH值至4.50?4.70 ;调节温度至0.0?
4.0°C;继续搅拌使其反应得到溶解液，按每100kg溶解液加入硅藻土 1.0?2.0kg和珍珠岩1.0?2.0kg，搅拌，开始过滤，控制过滤压力为O?0.3MPa，过滤速度为10?60kg/min，滤出液温度为0.0?5.(TC，溶解液压完后进行清洗回收，滤液用氢氧化钠溶液调节pH值至6.50?7.30，过滤沉淀高压灭菌废弃，得到过滤液；
[0017]步骤六:超滤透析、浓缩
[0018]用膜规格为1KD超滤器将步骤五得到的过滤液浓缩至蛋白质含量为8?12%，用4?6倍体积的2?8°C注射用水连续等体积透析，再用氢氧化钠溶液或醋酸-醋酸钠缓冲液调整制品pH值至6.60?6.90，用注射用水稀释控制最终蛋白质含量为20.0?50.0g/L ；
[0019]步骤七:加温纯化、过滤
[0020]将超滤后浓度为20.0?50.0g/L的蛋白溶液加温至50.0?55.0°C，恒温I?3小时，恒温结束降温至18?26°C，转移至白蛋白精制罐，用醋酸-醋酸钠缓冲液调节制品pH值至4.50?4.70，继续降温至0.0?0.5°C，用乙醇调节乙醇终浓度至11?13%，调节最终温度至-3.5?-2.5°C，继续搅拌反应，反应完全后按每100kg悬液加入珍珠岩1.0?
2.0kg，搅拌，开始过滤，控制过滤压力为O?0.2MPa，过滤速度为10?60kg/min，滤出液温度为-3.4?-2.(TC，悬液压滤完进行清洗回收，用氢氧化钠溶液调节过滤上清液PH值至
6.60?6.90，调节最终温度至-3.0?-2.0°C ;
[0021]步骤八:超滤透析、浓缩、配制
[0022]将步骤七得到的pH调节后的蛋白液经超滤浓缩至蛋白质含量为10?14%，然后依次进行连续等量透析，浓缩蛋白浓度至20.0?21.0%，按每克蛋白质加入0.15?0.18mmol辛酸钠的比例加入辛酸钠，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调整最终pH值至6.50?
7.30，再进行59.5?60.5°C恒温8?12小时巴氏病毒灭活和除菌分装，即可得到人血白蛋白半成品。
[0023]所述步骤一中是用8?10倍重量的0.0?4.0°C的含0.8?0.9%氯化钠和含0.6?0.8%枸橼酸钠的水溶液将组分IV-2沉淀溶解；其中含0.8?0.9%氯化钠和含0.6?0.8%枸橼酸钠的水溶液的配制方法为:称取8?9kg氯化钠和6?8kg枸橼酸钠，然后加入800?900kg注射用水中搅拌至完全溶解，再补加注射用水至1000kg。
[0024]所述步骤二中，是采用40%平衡液800?100Kg对压滤机进行清洗回收，所用的40%平衡液配制方法为??每1000kg注射用水加入_20°C以下的95% (v/v)乙醇563.3kg得到40% (v/v)的乙醇；然后在每1000kg 40% (v/v)乙醇中加入枸橡酸钠3.66kg和氯化钠
4.18kg ;用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至6.80-7.00 ;用-15°C冷媒调节温度至-6.0 ?-5.0°C ；
[0025]所述步骤三中，是采用42%平衡液800?100Kg对压滤机进行清洗回收，所用的42%平衡液配制方法为??每1000kg注射用水加入-20°C以下的95%乙醇607.9kg，得到42% (v/v)的乙醇，然后在每1000kg 42%的乙醇中加入枸橼酸钠3.67kg和氯化钠
3.14kg ;用pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至5.70-5.90 ;用-15 °C冷媒调节温度至-7.0 ?-5.00C ；
[0026]所述步骤七中所用的乙醇为-4.0?-3.0°C的12%乙醇。
[0027]所述连续等量透析依次采用的溶剂为:2?8°C的4?6倍浓缩后制品重量的0.9% NaCl溶液和4?6倍浓缩后制品重量的0.5% NaCl溶液。
[0028]本发明采用溶解组分IV-2沉淀、分离组分IV-1沉淀、分离组分IV-2沉淀、分离组分V沉淀、组分V沉淀溶解、过滤、超滤透析、浓缩、加温纯化、过滤、超滤透析、浓缩和配制的步骤用来制备人血白蛋白，各步骤前后紧密相连、层层相扣，所生产得到的人血白蛋白半成品，蛋白质含量在20.1 %以上，纯度不低于蛋白质总量的98.0%，pH值为6.5?7.3，残余乙醇含量应不高于0.025g/100ml。
【附图说明】
[0029]图1为本发明原料组分IV-2沉淀生产工艺流程图。
[0030]图2为本发明提取人血白蛋白的生产工艺流程图。
【具体实施方式】
[0031]原料取自人血白蛋白分离工艺中分离得到的组分IV-2沉淀，可以采用最常规的人血白蛋白分离工艺，例如图1所示的人血白蛋白分离工艺。
[0032]本发明提供了一种从组分IV-2沉淀中提取人血白蛋白的方法，工艺流程如图2所示，包括以下步骤:
[0033]步骤一:溶解组分IV-2沉淀
[0034]将组分IV-2沉淀用8?10倍重量的0.0?4.0°C的含0.8?0.9%氯化钠和含0.6?0.8%枸橼酸钠的水溶液搅拌6小时以上至完全溶解；
[0035]其中含0.8?0.9%氯化钠和含0.6?0.8%枸橼酸钠的水溶液的配制方法为:称取8?9kg氯化钠和6?8kg枸橡酸钠，然后加入800?900kg注射用水中搅拌至完全溶解，再补加注射用水至1000kg。
[0036]步骤二:分离组分IV-1沉淀
[0037]用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液(醋酸-醋酸钠缓冲液配制方法为:称取1088.6g三水合醋酸钠，倒入1L大立瓶中，用适量注射用水溶解，摇溶后，量取2288ml冰醋酸，加入到溶液中，加注射用水至l^L，混匀即得，下同)调节步骤一的组分IV-2沉淀的溶解液pH值至6.00?6.30，用-15°C冷媒将温度降至-1.0?0.0°C，用_20°C以下95% (v/v)乙醇调节乙醇终浓度至39?41 % (v/v)，用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液或0.5mol/L的氢氧化钠溶液调整PH值至6.00?6.30，用_15°C冷媒调节悬液温度至_6.0°C?_4.0°C,在搅拌速度为50?10rpm下搅拌反应2?3小时，用40%平衡液800?1200Kg对整个压滤管路及压滤机进行平衡降温，设定吹扫时间20?40分钟，用-7.5?-3.5°C预冷洁净压缩空气吹干滤板(德国Begerow公司生产，型号:PX50，规格680*779mm)，使排放温度达到-5.5?-3.5°C。开始悬液压滤，控制过滤压力为O?0.3MPa，过滤速度为20?90kg/min，滤出液温度为-5.5?-3.5°C，悬液压完设定吹扫时间30?60分钟，用预冷洁净压缩空气吹干滤板，用40%平衡液800?100Kg对压滤机进行清洗回收，回收液并入上清液罐，设定吹扫时间30?150分钟，再使用-7.5?-3.5 °C预冷洁净压缩空气进行吹干，收集组分IV-1上清液，组分IV-1沉淀高压灭菌后废弃；
[0038]所用的40%平衡液配制方法为??每1000kg注射用水加入_20°C以下的95% (v/v)乙醇563.3kg得到40% (v/v)的乙醇；然后在每1000kg 40% (v/v)乙醇中加入枸橼酸钠
3.66kg和氯化钠4.18kg ;用口財.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至6.80-7.00 ;用_15°〇冷媒调节温度至-6.0?-5.0°C ;
[0039]步骤三:分离组分IV-2沉淀
[0040]用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液调节组分IV-1上清液pH值至5.70?5.90，用-20°C以下95% (v/v)乙醇调节乙醇终浓度至41.5?42.5% (v/v)，加完乙醇后取样检测PH值并用pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液或0.5mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至5.70?
5.90，用-15°C冷媒调节反应温度至-7.0°C?-5.0°C，在搅拌速度为50?10rpm下搅拌反应2?3小时，反应完全后按每100kg制品加入娃藻土 2.0?3.0kg和珍珠岩2.0?
3.0kg，以搅拌速度为50?10rpm搅拌反应30分钟，用42%平衡液800?1200Kg对整个压滤管路及压滤机进行平衡降温，设定吹扫时间20?40分钟，用-8.0?-4.(TC预冷洁净压缩空气吹干滤板(德国Begerow公司生产，型号:PX50，规格680*779mm)，使排放温度达到-5.5?-3.5°C，开始悬液压滤，控制过滤压力为O?0.3MPa，过滤速度为20?90kg/min,滤出液温度为-6.0?-4.0°C，悬液压完设定吹扫时间30?60分钟，用预冷洁净压缩空气吹干滤板，用42%平衡液800?100Kg对压滤机进行清洗回收，回收液并入压滤上清液罐，设定吹扫时间30?150分钟，再使用-7.5?-3.5°C预冷洁净压缩空气进行吹干，收集组分IV-2上清液，组分IV-2沉淀高压灭菌废弃；
[0041]所用的42%平衡液配制方法为??每1000kg注射用水加入-20°C以下的95%乙醇607.9kg，得到42% (v/v)的乙醇，然后在每1000kg 42%的乙醇中加入枸橼酸钠3.67kg和氯化钠3.14kg ;用pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液调节pH值至5.70-5.90 ;用_15°C冷媒调节温度至-7.0?-5.0 °C ；
[0042]步骤四:分离组分V沉淀
[0043]用4mol/L醋酸和95 %乙醇混合液(每10kg注射用水，加入28.9L冰醋酸和TL 4kg乙醇)调节组分IV-2上清液的pH值至4.70?4.90，用-15 °C冷媒调节温度至-9.0?-8.0 °C，在搅拌速度为50?10rpm下继续搅拌反应2?3小时，用-9.0?-8.0°C的42% (v/v)乙醇1000?2000kg对整个压滤管路及压滤机进行平衡降温，设定吹扫时间30分钟