部指导序列（EGS)寡核苷酸、可变剪接物（alternate splicer)、引物、探针以 及其他与靶核酸的至少一部分杂交的寡聚化合物。因此，可将这些化合物以单链、双链、部 分单链或环状寡聚化合物的形式引入。
[0043] 在本发明的情况中，术语"寡核苷酸"是指核糖核酸（RNA)或脱氧核糖核酸（DNA) 或其模拟物的寡聚物或聚合物。术语"寡核苷酸"，也包括天然和/或经修饰单体或键 (linkage)的线性或环状寡聚体，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-异头物形 式、肽核酸（PNA)、锁核酸（LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能够通过单体与 单体相互作用的规律模式（例如沃森-克里克（Watson-Crick)型碱基配对、胡格斯腾型 (Ho6gsteen)或反向胡格斯腾型碱基配对等）特异地结合靶多核苷酸。
[0044] 寡核苷酸可为"嵌合的"，即，由不同的区组成。在本发明的情况中，"嵌合的"化合 物为寡核苷酸，其包含两个或更多个化学区，例如，DNA区、RNA区、PNA区等。每个化学区由 至少一个单体单元（即，在寡核苷酸化合物的情况下为核苷酸）组成。这些寡核苷酸典型 地包含至少一个区，其中所述寡核苷酸为经修饰的以表现出一种或多种所需特性。寡核苷 酸的所需特性包括但不限于，例如增强的对核酸酶降解的抗性、增强的细胞摄取和/或增 强的对靶核酸的结合亲和力。因此寡核苷酸的不同区可具有不同的特性。本发明的嵌合寡 核苷酸可形成为两种或更多种如上所述的寡核苷酸、修饰寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核 苷酸类似物的混合结构。
[0045] 寡核苷酸可由可"全符合状态（in "register"）"地连接（即此时单体像在天然 DNA-样连续地连接）或通过间隔物连接的区组成。所述间隔物意在构成区之间的共价 "桥"，并在优选的情况下具有不超过约100个碳原子的长度。所述间隔物可携带不同的功 能性，例如具有正或负电荷的、具有特殊的核酸结合特性（嵌入剂、沟结合剂、毒素、荧光团 等）、为亲脂的、诱导特殊的二级结构如例如诱导α -螺旋的含丙氨酸的肽。
[0046] 本文所用的"BDNF"和"脑源神经营养因子"包括所有家族成员、突变体、等位基因、 片段、种类（species)、编码和非编码序列、有义和反义多核苷酸链等。
[0047] 本文所用的措词"脑源神经营养因子"、"脑来源的神经营养因子"和BDNF在文献 中被认为是相同的且在本申请中可交换地使用。
[0048] 本文所用的术语"对......特异的寡核苷酸"或"靶向于......的寡核苷酸"是 指具有以下序列的寡核苷酸：（i)能够与靶定基因的一部分形成稳定的复合体，或（ii)能 够与祀定基因的mRNA转录物的一部分形成稳定的双链体。复合体和双链体的稳定性可通 过理论计算和/或体外测定来确定。用于确定杂交复合体和双链体的稳定性的示例性测定 法描述于下文实施例中。
[0049] 本文所用的术语"靶核酸"包括DNA、从这类DNA转录的RNA (包括前mRNA和mRNA)， 以及从这类RNA衍生的cDNA、编码序列、非编码序列、有义或反义多核苷酸。寡聚化合物与 其靶核酸的特异性杂交干扰核酸的正常功能。这种通过特异地与靶核酸杂交的化合物对该 靶核酸的功能调节，一般称为"反义"。待干扰的DNA功能包括例如复制和转录。待干扰的 RNA功能，包括所有的生命机能，例如，RNA向蛋白质翻译位点的易位、蛋白质自RNA的翻译、 产生一种或多种mRNA种类的RNA剪接，以及可由RNA参与或促进的催化活性。对靶核酸功 能的这类干扰的整体效果为对编码产物或寡核苷酸表达的调节。
[0050] RNA干扰"RNAi"由双链RNA(dsRNA)分子介导，该分子具有与其"靶"核酸序列的 序列特异性同源性。在本发明的某些实施方案中，介体为5-25个核苷酸的"小干扰"RNA双 链体（siRNA)。siRNA通过称为切酶（Dicer)的RNA酶对dsRNA的加工得到。siRNA双链体 产物募集到叫做RISC(RNA诱导的沉默复合体）的多蛋白siRNA复合体中。不希望受任何 具体理论所约束，据认为随后RISC被引向靶核酸（适当地为mRNA)，其中siRNA双链体以 序列特异性的方式相互作用来介导催化方式的切割。可依照本发明使用的小干扰RNA可根 据本领域众所周知和普通技术人员熟悉的程序来合成和使用。用于本发明的方法中的小干 扰RNA适当地包含约1-约50个核苷酸（nt)。在非限制性实施方案的实例中，siRNA可包 含约5-约40nt、约5-约30nt、约10-约30nt、约15-约25nt、或约20-25个核苷酸。
[0051] 适当寡核苷酸的挑选通过使用电脑程序来辅助，该程序自动比对核酸序列并指示 具有同一性或同源性的区。将这类程序用于比较通过例如搜索诸如GenBank等的数据库或 通过测序PCR产物而获得的核酸序列。对来自一系列物种的核酸序列的比较，允许选择在 物种之间显示适度同一性的核酸序列。在未测序基因的情况下，进行DNA印迹来确定在靶 物种和其他物种的基因之间的同一性程度。如本领域众所周知的，通过在不同的严格程度 下进行DNA印迹，可能获得同一性的近似衡量。这些程序允许选择对待控制的受试者中的 靶核酸序列表现出高度的互补性并且对其他物种中的相应核酸序列表现出较低程度的互 补性的寡核苷酸。本领域的技术人员将认识到，在挑选用于本发明的适当的基因区方面具 有相当大的自由。
[0052] "酶促RNA"意为具有酶活性的RNA分子（〇6(*，（1988)丄八11161^&11.]^(1· Assoc. 260,3030-3035)。酶促核酸（核酶）通过首先结合靶RNA来起作用。这类结合通过 酶促核酸的靶结合部分进行，所述靶结合部分保持紧密靠近起到切割靶RNA分子的作用的 酶部分。因此，酶促核酸首先识别而后通过碱基配对结合靶RNA，且一旦结合到正确的位点， 即酶促切割靶RNA。
[0053] "诱饵RNA"意为模拟配体的天然结合域的RNA分子。因此诱饵RNA与天然结合靶 标竞争与特异性配体的结合。例如，已显示HIV反式激活应答（TAR)RNA的过表达可充当 "诱饵"并有效地结合HIV tat蛋白，从而阻止其结合到在HIV RNA中编码的TAR序列。这 意指特定的实例。本领域的技术人员将认识到，这只是一个实例，而其他的实施方案可使用 本领域一般已知的技术容易地产生。
[0054] 本文所用的术语"单体"通常指通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成大小范围 从少量单体单元（例如从约3-4)到约数百个单体单元的寡核苷酸的单体。磷酸二酯键的类 似物包括：硫代磷酸醋、二硫代磷酸醋、甲基膦酸醋、硒代磷酸醋（phosphoroselenoate)、 氨基磷酸酯等，如下文更充分地描述的。
[0055] 术语"核苷酸"涵盖天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸。本领域的技术人 员应清楚的是，先前认为"非天然存在"的多种核苷酸后来已在自然中发现。因此，"核苷 酸"不仅包括已知的含嘌呤和嘧啶杂环的分子，而且还包括其杂环类似物和互变异构体。其 他类型的核苷酸的说明性实例为以下分子，其含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧 啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮杂黄嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌 呤、N4, M-桥亚乙基胞喃啶（ethanocytosin)、N6, N6-桥亚乙基-2, 6-二氨基嗓呤、5-甲 基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲 基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和在Benner等的美国专利第5, 432, 272号中 描述的"非天然存在的"核苷酸。术语"核苷酸"意在涵盖这些实例以及其类似物和互变异 构体中的每一个和全部。尤其令人关注的核苷酸为含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和 尿嘧啶的核苷酸，其被认为是有关人中的治疗和诊断应用的天然存在核苷酸。核苷酸包括 天然2' -脱氧和2' -轻基糖，例如，如Kornberg和Baker，DNA复制（DNA Replication)， 第2版（Freeman，San Francisco, 1992)中所述的，以及其类似物。
[0056] 提及核苷酸的"类似物"包括具有经修饰的碱基部分和/或经修饰的糖部分的 合成核苷酸（参见例如，由Scheit，核苷酸类似物（Nucleotide Analogs)，John Wiley， New York，1980 ;Freier 和 Altmann，（1997)Nucl. Acid. Res.，25(22)，4429-4443，Toulm6， J. J. , (2001)Nature Biotechnology 19 ：17-18 ；Manoharan M., (1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489 ：117-139 ；Freier S. M. , (1997)Nucleic Acid Research,25： 4429-4443, Uhlman, E. , (2000)Drug Discovery&Development, 3 :203-213, Herdewin P., (2000) Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.，10 :297-310 -般描述的）；2'-0,3'-C-连接 的[3.2.0]二环阿糖核苷。这类类似物包括设计以增强结合特性的合成核苷酸，所述结合 特性为例如双链体或三链体稳定性、特异性等。
[0057] 本文所用的"杂交"意为寡聚化合物的基本上互补链的配对。一种配对的机理涉 及寡聚化合物的链的互补核苷或核苷酸碱基（核苷酸）之间的氢键合，其可为沃森-克里 克、胡格斯腾型或反向胡格斯腾型氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶为互补的核苷酸，其通 过形成氢键配对。杂交可在各种环境下发生。
[0058] 如果反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而导致功能和/或活性 的调节，并且在需要特异性结合的条件下（即在体内测定或治疗性处理情况中的生理条件 下，以及其中在体外测定情况下进行测定的条件下）存在足够程度的互补性来避免所述反 义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合，反义化合物为"可特异地杂交的"。
[0059] 本文所用的短语"严格杂交条件"或"严格条件"是指以下条件：在该条件下本发 明的化合物与其靶序列杂交，但与最少数量的其他序列杂交。严格条件为序列依赖的且在 不同环境下将不同，在本发明的情况中，在其下寡聚化合物与靶序列杂交的"严格条件"由 寡聚化合物的性质和组成以及正在其中研宄它们的试验来确定。一般而言，严格杂交条件 包括低浓度（< 〇. 15M)的含有诸如Na+或K+等无机阳离子的盐（即，低离子强度）、高于 20°C -25°C而低于寡聚化合物：靶序列复合体的Tm的温度，以及变性剂的存在，例如甲酰 胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜，或去污剂十二烷基硫酸钠（SDS)。例如，杂交率对于每1% 甲酰胺降低I. 1%。高严格杂交条件的实例为〇. IX氯化钠-柠檬酸钠缓冲液（SSC)/0. 1% (w/v) SDS、60°C 下达 30 分钟。
[0060] 本文所用的"互补性"是指在一条或两条寡聚链上两个核苷酸之间精确配对的能 力。例如，如果在反义化合物的某个位置上的核碱基能够与在靶核酸的某个位置上的核碱 基氢键键合，所述靶核酸为DNA、RNA或寡核苷酸分子，则认为所述寡核苷酸和所述靶核酸 之间氢键键合的位置为互补位置。当可彼此氢键键合的核苷酸占据了每个分子中足够数量 的互补位置时，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子为彼此互补的。因此，"可特 异性杂交的"和"互补的"为用于表示在足够数量的核苷酸上有足够程度的精确配对或互补 性以使得稳定和特异的结合发生在寡聚化合物和靶核酸之间的术语。
[0061] 本领域中理解，寡聚化合物的序列不需要与其可特异杂交的靶核酸的序列100% 互补。此外，寡核苷酸可在一个或多个区段上杂交，使得间插或邻近的区段不涉及杂交事 件（例如，环结构、错配或发夹结构）。本发明的寡聚化合物包含与其靶向的靶核酸序列内 的靶区域至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至 少约95%、或至少约99%的序列互补。例如，其中反义化合物的20个核苷酸中有18个与 靶区域互补且因而会特异地杂交的反义化合物，表示90%互补性。在此实例中，余下的非 互补核苷酸可与互补核苷酸是聚簇或散布的且不需要彼此邻接或邻接互补核苷酸。因此， 长度为18个核苷酸的反义化合物具有4 (四）个非互补核苷酸，该非互补核苷酸位于与靶 核酸完全互补的两个区的侧翼，所述反义化合物会具有与靶核酸77. 8%的总互补性，因此 落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸区的互补性百分比可使用本领域已知的BLAST 程序（基本局部比对搜索工具）和PowerBLAST程序常规地确定。百分同源性、序列同一 性或互补性可通过例如Gap程序（Wisconsin序列分析包，Unix操作系统版本8, Genetics Computer Group，University Research Park，Madison Wis.)使用默认设置来确定，该程 序使用 Smith 和 Waterman 的算法（Adv. Appl. Math.，（1981) 2,482-489) 〇
[0062] 本文所用的术语"解链温度（Tm) "是指在限定的离子强度、pH和核酸浓度下，平衡 时50%与靶序列互补的寡核苷酸与靶序列杂交的温度。典型地，对于短的寡核苷酸（例如， 10-50个核苷酸）而言严格条件为以下条件，其中盐浓度至少为约0. 01-1. OM Na离子浓度 (或其他盐），pH 7. 0-8. 3且温度至少为约30°C。严格条件也可通过外加诸如甲酰胺等去 稳定剂来达到。
[0063] 本文所用的"调节"意为在基因表达方面的增加（刺激）或减少（抑制）。
[0064] 术语"变体"，当用于多核苷酸序列的情况下时，可包括与野生型基因相关的多核 苷酸序列。此定义也可包括，例如，"等位基因的"、"剪接"、"物种"或"多态性"变体。剪接 变体可具有与参比分子显著的同一性，但因为在mRNA加工期间外显子的可变剪接而通常 具有更多或更少数量的多核苷酸。对应的多肽可具有附加的功能域或域的缺失。物种变体 为在不同物种之间不同的多核苷酸序列。本发明中尤其实用的是野生型基因产物的变体。 变体可由核酸序列中的至少一个突变产生并可导致产生改变的mRNA或者其结构或功能可 能改变或不变的多肽。任何给定的天然或重组基因可不具有、或者具有一个或许多等位基 因形式。产生变体的常见突变变化一般归因于核苷酸的自然缺失、添加或取代。这些变化 类型中的每一个可单独或与其他类型联合发生，在给定序列中发生一次或多次。
[0065] 产生的多肽一般将具有相对于彼此的显著的氨基酸同一性。多态性变体为在给 定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态性变体也可包括"单核苷酸多态 性"（SNP)或单碱基突变，其中多核苷酸序列因一个碱基而不同。SNP的存在可指示例如具 有疾病状态倾向（即与抗性相对的易感性）的某个群体。
[0066] 衍生物多核苷酸包括经过化学修饰的核酸，例如用烷基、酰基或氨基置换氢。衍生 物（例如，衍生物寡核苷酸）可包含非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间键。它们 中示例性的是硫代磷酸酯及本领域已知的其他含硫的物质。衍生物核酸也可含有标记，包 括放射性核苷酸、酶、荧光剂、化学发光剂、显色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等等。
[0067] "衍生物"多肽或肽为经修饰的多肽或肽，例如，通过糖基化、聚乙二醇化、磷酸化 作用、硫酸盐化作用、还原/烷基化、酰化、化学偶联或温和福尔马林处理。也可将衍生物修 饰以含有可检测标记（直接地或间接地），包括但不限于放射性同位素、荧光