点的前50个核苷酸。用于本发明的另一种靶区域为5'帽区。 [0110] 尽管一些真核mRNA转录物为直接翻译的，但是许多包含一个或多个称为"内含 子"的区域，其在翻译前被从转录物中切除。余下的（且因此翻译的）区称为"外显子"，并 将其剪接在一起形成连续的mRNA序列。在一个实施方案中，靶向剪接位点（S卩，内含子-外 显子连接处或外显子-内含子连接处）在疾病牵涉到异常剪接或疾病牵涉特定剪接产物 过度产生的状况中特别有用。因重排或缺失所致的异常融合连接为靶位点的另一个实施方 案。经由来自不同基因来源的两个（或更多个）mRNA的剪接过程产生的mRNA转录物称为 "融合转录物"。内含子可使用靶向于例如DNA或前-mRNA的反义化合物来有效地靶向。
[0111] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合到靶多核苷酸的编码和/或非编码区并调 节靶分子的表达和/或功能。
[0112] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合到天然反义多核苷酸并调节靶分子的表达 和/或功能。
[0113] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸结合到有义多核苷酸并调节靶分子的表达和/ 或功能。
[0114] 可变RNA转录物可产生自DNA的相同基因组区。这些可变转录物一般称为"变体"。 更具体地，"前mRNA变体"为产生自相同的基因组DNA的转录物，其与产生自相同的基因组 DNA的其他转录物在其起始或终止位置上不同且包含内含子和外显子序列二者。
[0115] 当剪接期间切除了一个或多个外显子或内含子区或其部分时，前mRNA变体产生 更小的"mRNA变体"。因此，mRNA变体为经加工的前mRNA变体，并且由于剪接导致每种独 特的前mRNA变体必须总是产生独特的mRNA变体。这些mRNA变体也称为"可变剪接变体"。 如果未发生前mRNA变体的剪接，则前mRNA变体与mRNA变体完全相同。
[0116] 变体可通过使用可变信号启动或终止转录来产生。前mRNA和mRNA可具有多于一 个起始密码子或终止密码子。起源于使用可变起始密码子的前mRNA或mRNA的变体称为该 前mRNA或mRNA的"可变起始变体"。使用可变终止密码子的转录物称为该前mRNA或mRNA 的"可变终止变体"。可变终止变体的一个具体类型为"聚腺苷酸变体"，其中所产生的多重 转录物起因于转录机构对"聚腺苷酸终止信号"之一的可变选择，从而产生终止在独特的聚 腺苷酸位点上的转录物。在本发明的情况内，本文所述的变体类型也为靶核酸的实施方案。
[0117] 将反义化合物与之杂交的靶核酸上的位置定义为活性反义化合物靶向于的靶区 域的至少5个核甘酸长的部分。
[0118] 虽然将某些示例性靶区段的具体序列列举于此，但是本领域的技术人员会认识 到，这些用于说明和描述在本发明范围内的具体实施方案。根据本公开内容，其他靶区段可 由本领域普通技术人员容易地鉴定。
[0119] 长度为5-100个核苷酸并包含选自说明性优选靶区段之内的一段至少五（5)个连 续的核苷酸的延伸的革G区段认为同样适合革巴向。
[0120] 靶区段可包括DNA或RNA序列，其包含来自说明性优选靶区段之一的5'末端的至 少5个连续核苷酸（余下的核苷酸为相同DNA或RNA的连续延伸，其开始于靶区段5'末端 的紧接上游且持续直到该DNA或RNA包含约5-约100个核苷酸为止）。类似优选的靶区段 由以下DNA或RNA序列表示，该序列包含来自说明性优选靶区段之一的3'末端的至少5个 连续核苷酸（余下的核苷酸为相同DNA或RNA的连续延伸，其开始于靶区段3'末端的紧接 下游且持续直到该DNA或RNA包含约5-约100个核苷酸为止）。本领域技术人员根据本文 所说明的靶区段，无需过度试验就能够鉴定进一步优选的靶区段。
[0121] 一旦鉴定一个或多个靶区域、区段或位点，就选出与该靶标充分互补的反义化合 物，即充分良好地且以足够的特异性杂交以得到所需的效果。
[0122] 在本发明的实施方案中，寡核苷酸与特定靶标的反义链结合。所述寡核苷酸长度 为至少5个核苷酸且可为合成的，使得每个寡核苷酸靶向于重叠的序列，由此将寡核苷酸 合成为覆盖靶多核苷酸的全长。靶标也包括编码区以及非编码区。
[0123] 在一个实施方案中，优选通过反义寡核苷酸来靶向于特定核酸。将反义化合物靶 向于特定核酸为多步过程。该过程通常开始于鉴定其功能待调节的核酸序列。这可为，例 如其表达与特定的病症或疾病状态有关的细胞基因（或从该基因转录的mRNA)，或非编码 多核苷酸，例如非编码RNA(ncRNA)。
[0124] 可将RNA归类为（1)信使RNA(mRNA)，其被翻译成蛋白，和（2)非蛋白质编码的 RNA(ncRNA)。ncRNA包括微RNA、反义转录物和包含高密度的终止密码子并缺少任何广泛的 "开放阅读框"的其他转录单元（TU)。许多ncRNA似乎开始于蛋白编码基因座的3'非翻译 区C UTR)中的起始位点。ncRNA常常为罕见的且至少一半已由FANTOM协会测序的ncRNA 似乎未聚腺苷酸化。大多数研宄者因为明显的原因而关注经加工并输出到细胞质的聚腺苷 酸化mRNA。近来，已显示非聚腺苷酸化核RNA的群体可能非常巨大，且许多这类转录物产生 于所谓的基因内区。ncRNA可调节基因表达的机制为通过与靶转录物的碱基配对。通过碱 基配对起作用的RNA可分组成（1)顺式编码RNA，其在相同的基因位置、但在与其所作用的 RNA相反的链上编码，因此显示对其靶标完美的互补性，和（2)反式编码RNA，其在与其所作 用的RNA不同的染色体位置上编码，一般不表现出与其靶标完美的碱基配对潜能。
[0125] 不希望受到理论的约束，通过本文所述的反义寡核苷酸来扰乱反义多核苷酸可改 变相应有义信使RNA的表达。然而，此调节可能为非调和的（反义敲减导致信使RNA上升） 或致的（反义敲减导致伴随的信使RNA下降）。在这些情况下，可将反义寡核苷酸靶向于反 义转录物的重叠或非重叠部分，引起其敲减或隔离。编码以及非编码反义物可以相同的方 式来靶向，并且任一种类别均能够调节相应有义转录物一一以调和或非调和的方式。用于 鉴定针对靶标使用的新寡核苷酸的策略可基于通过反义寡核苷酸或任何其他调节所需靶 标的方法来敲减反义RNA转录物。
[0126] 策略1 :在非调和调节的情况下，敲减所述反义转录物提升常规（有义）基因的表 达。若后者基因编码已知或假定的药物靶标，则其反义配对物的敲减可预想到地模拟受体 激动剂或酶刺激剂的作用。
[0127] 策略2 :在调和调节的情况下，可以伴随地敲减反义和有义转录物两者，从而达到 常规（有义）基因表达的协同下降。如果例如将反义寡核苷酸用于进行敲减，则此策略可 用于将靶向的一种反义寡核苷酸应用于有义转录物和将另一种反义寡核苷酸应用于相应 的反义转录物，或应用同时靶向于重叠的有义和反义转录物的单个有力对称的反义寡核苷 酸。
[0128] 根据本发明，反义化合物包括反义寡核苷酸、核酶、外部指导序列（EGS)寡核苷 酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰（RNAi)化合物（例如siRNA化合物），以及与靶核 酸的至少一部分杂交且调节其功能的其他寡聚化合物。因此，其可为DNA、RNA、DNA样、RNA 样、或其混合物，或可为这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可为单链、双链、环状或 发夹寡聚化合物且可包含结构元件，例如内部或末端突起（bulge)、错配或环。将反义化合 物常规地制备为线性的，但可被连接或者另外制备成环状和/或分枝的。反义化合物可包 括构建体，例如杂交以形成完全或部分双链化合物的两条链，或具有足够自身互补性以允 许杂交并形成完全或部分双链化合物的单链。可将所述两条链内部连接而留下游离的3 '或 5'末端，或可将其连接形成连续的发夹结构或环。发夹结构可在5'或3'末端上包含突出 端，从而产生单链特征的延伸。所述双链化合物任选可在末端上包含突出端。进一步的修 饰可包括与末端之一、经挑选的核苷酸位置、糖位置或与核苷间键之一连接的缀合基团。或 者，所述两条链可经由非核酸部分或连接基团来连接。当仅由一条链形成时，dsRNA可呈自 身互补的发夹型分子形式，其在其自身上对折形成双链体。因此，所述dsRNA可为完全或部 分双链的。基因表达的特异性调节可通过在转基因细胞系中稳定表达dsRNA发夹来完成， 然而，在一些实施方案中，基因表达或功能为上调的。当由两条链或呈其自身对折以形成双 链体的自身互补发夹型分子形式的单链形成时，所述两条链（或单链的双链体形成区）为 以沃森-克里克模式碱基配对的互补RNA链。
[0129] 一旦引入系统，本发明的化合物可引起一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现靶 核酸的切割或其他修饰，或可经由基于占据的机制来运作。一般而言，核酸（包括寡核苷 酸）可描述为"DNA样"（即，一般具有一个或多个2'脱氧糖和一般地具有T而不是U碱 基）或"RNA样"（即，一般具有一个或多个2'羟基或2'修饰的糖和一般具有U而不是T 碱基）。核酸螺旋可采取多于一种类型的结构，最常见地A和B型。据认为，一般而言，具有 B型样结构的寡核苷酸为"DNA样"而具有A型样结构的寡核苷酸为"RNA样"。在一些（嵌 合的）实施方案中，反义化合物可包含A型区和B型区两者。
[0130] 在一个实施方案中，所需的寡核苷酸或反义化合物包括以下的至少一种：反义 RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包含经修饰的键的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干 扰 RNA (siRNA);微干扰 RNA (miRNA);小时序 RNA (StRNA);或短发夹 RNA (shRNA);小 RNA 诱 导的基因激活（RNAa);小激活RNA(saRNA)或其组合。
[0131] dsRNA也可激活基因表达，这是已被称为"小RNA诱导的基因激活"或RNAa的机 制。靶向于基因启动子的dsRNA诱导相关基因的有效转录激活。RNAa在人细胞中使用合成 dsRNA(称为"小激活RNA"（saRNA))证实。目前未知RNAa在其他生物体中是否为保守的。
[0132] 已发现小双链RNA (dsRNA)(例如小干扰RNA (siRNA)和微RNA (miRNA))是称为RNA 干扰（RNAi)的进化保守机制的触发物。RNAi总是经由重构染色质来导致基因沉默，从而抑 制转录、降解互补mRNA或阻断蛋白翻译。然而，在下文实施例章节详述的例子中，显示寡核 苷酸增加脑源神经营养因子（BDNF)多核苷酸和其编码产物的表达和/或功能。dsRNA也可 充当小激活RNA(saRNA)。不希望受理论约束，通过靶向于基因启动子中的序列，saRNA在称 为dsRNA诱导的转录激活（RNAa)的现象中诱导靶基因表达。
[0133] 在另一个实施方案中，本文鉴定的"优选靶区段"可用于筛选调节脑源神经营养因 子（BDNF)多核苷酸表达的另外的化合物。"调节剂"为减少或增加编码BDNF的核酸分子 的表达的化合物并包含与优选靶区段互补的至少5个核苷酸的部分。筛选方法包括以下步 骤：使编码BDNF的有义或天然反义多核苷酸的核酸分子的优选靶区段与一种或多种候选 调节剂接触，以及选择一种或多种减少或增加编码BDNF多核苷酸的核酸分子表达的候选 调节剂（例如SEQ ID NO :12-49)。一旦显示一种或多种候选调节剂能够调节（例如减少 或增加）编码BDNF多核苷酸的核酸分子的表达，则可将所述调节剂用于BDNF多核苷酸功 能的进一步调查研宄，或用作依照本发明的研宄、诊断或治疗剂。
[0134] 靶向于天然反义序列优选地调节靶基因的功能。例如，BDNF基因（例如登录号 NM_170735和NM_007540)。在一个实施方案中，靶标为BDNF基因的反义多核苷酸。在一个 实施方案中，反义寡核苷酸靶向于BDNF多核苷酸（例如登录号NM_170735和NM_007540) 的有义和/或天然反义序列、其变体、等位基因、同种型、同源物、突变体、衍生物、片段和互 补序列。优选所述寡核苷酸为反义分子且所述靶标包括反义和/或有义BDNF多核苷酸的 编码和非编码区。
[0135] 本发明的优选靶区段也可与本发明的其相应互补反义化合物结合，以形成稳定的 双链（双链体）寡核苷酸。
[0136] 本领域中已显示这类双链寡核苷酸部分经由反义机制来调节靶表达和调节翻译 以及RNA加工。此外，所述双链部分可经受化学修饰。例如，已显示这类双链部分通过所述 双链体的反义链与靶标的经典杂交来抑制该靶标，从而触发靶标的酶促降解。
[0137] 在一个实施方案中，反义寡核苷酸靶向于脑源神经营养因子（BDNF)多核苷酸（例 如登录号NM_170735和NM_007540)、其变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互 补序列。优选所述寡核苷酸为反义分子。
[0138] 依照本发明的实施方案，靶核酸分子不限于单独的BDNF而是延伸到其任何多核 苷酸变体及产生、影响、作用或导致BDNF表达产物和或/其任何同种型或者与BDNF表达产 物和或/其任何同种型相关的任何多核苷酸。
[0139] 在一个实施方案中，寡核苷酸靶向于BDNF多核苷酸的天然反义序列（例如，如SEQ ID NO :3-11所示的多核苷酸），以及其任何变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段 和互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO :12-49所述。
[0140] 在一个实施方案中，所述寡核苷酸与BDNF反义物的核酸序列互补或结合，并调节 BDNF分子的表达和/或功能，所述核酸序列包括但不限于与BDNF多核苷酸有关的非编码有 义和/或反义序列。
[0141] 在一个实施方案中，所述寡核苷酸与如SEQ ID NO :3-11所示的BDNF天然反义物 的核酸序列互补或结合，并调节BDNF分子的表达和/或功能。
[0142] 在一个实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO :12-49的至少5个连续核苷酸的序 列且调节BDNF分子的表达和/或功能。
[0143] 多核苷酸靶标包括BDNF (包括其家族成员、BDNF的变体）；BDNF的突变体（包括 SNP) ;BDNF的非编码序列；BDNF的等位基因；物种变体、片段等等。优选所述寡核苷酸为反 义分子。
[0144] 在一个实施方案中，靶向于BDNF多核苷酸的寡核苷酸包括：反义RNA、干扰 RNA (RNAi)、短干扰 RNA (siRNA);微干扰 RNA (miRNA);小时序 RNA (StRNA);或短发夹 RNA(shRNA);小RNA诱导的基因激活（RNAa);或小激活RNA(saRNA)。
[0145] 在一个实施方案中，脑源神经营养因子（BDNF)多核苷酸的靶向（例如SEQ ID NO : 3-55)调节这些靶标的表达或功能。在一个实施方案中，表达或功能相比于对照为上调的。 在一个实施方案中，表达或功能相比于对照为下调的。
[0146] 在一个实施方案中，反义化合物包括如SEQ ID NO :12-49所示的序列。这些寡核 苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷酸、更短或更长的片段、经修饰的键等等。
[0147] 在一个实施方案中，SEQ ID NO :12-49包含一个或多个LNA核苷酸。表1显示可 用于本发明的方法中的示例性反义寡核苷酸。
[0148] 表 1:
【主权项】
1. 一种调节生物系统中脑源神经营养因子（BDNF)多核苷酸的功能和/或表达的方法， 包括：使所述生物系统与长度5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少 一种寡核苷酸与脑源神经营养因子（BDNF)多核苷酸的天然反义序列的反向互补序列具有 至少50%的序列同一性，从而调节所述脑源神经营养因子（BDNF)多核苷酸的功能和/或表 达，条件是排除具有SEQ ID NO:50-55的寡核苷酸。
2. 根据权