从玉米中分离的双向启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从植物中分离的启动子，尤其涉及从玉米（Zeamays)中分离的双向启 动子及其应用，属于双向启动子的分离和应用领域。
【背景技术】
[0002] 通过导入外源基因使植物获得新的性状并能稳定遗传是植物基因工程的最终目 的。花椰菜病毒CaMV35S启动子以及玉米UBI启动子作为稳定、高效的外源启动子，一直 被人们广泛的使用。然而在转基因过程中，由于重复序列的出现会引起基因沉默现象，尤其 是进行多个基因导入时，基因沉默现象会更严重，以至严重影响了转基因植株的获得和后 代的稳定性。在进行两个或两个以上基因导入时，通常需要这些基因的表达量、表达时间和 位置的同一性，进而确保转入基因行使正常的功能，但使用35S启动子或者玉米UBI启动子 很难达到这样的要求，这些都是植物基因工程中亟待解决的技术问题。
[0003] 对于转基因引起的基因沉默现象人们已经有了比较深入的认识，引起转基因沉默 有多种因素，其中最主要的就是重复序列的产生，尤其是多个基因导入时，更人为的造成了 多个35S启动子插入的情况，对此至今尚无有效的解决方法。随着基因组学的发展，多种生 物基因组测序已完成，经过生物信息学分析人们发现了双向启动子的存在，这为利用植物 自身的双向启动子进行转基因操作从而避免多基因插入引起的基因沉默现象提供了可能。 通过表达载体将最大数量的基因整合到植物基因组中，需要限制用于表达转基因核酸的调 控序列的数量和大小，双向启动子为实现该目标功不可没。双向表达系统允许以化学计量 学的方式控制转基因的表达，此外，由于双向表达的缘故，一个表达控制序列能控制两个目 的基因的表达，能够有效降低导入生物体重进行异源基因表达的表达盒数量并能有效避免 多基因插入引起的基因沉默现象。
[0004] 玉米（Zeamays)是中国最大的粮食作物，也是重要的转基因作物。从玉米中分离 获得双向启动子，可以利用双向启动子将两个目的基因在植物中进行双向表达并有效避免 多基因表达所存在的基因沉默现象。
【发明内容】
[0005] 本发明目的之一是提供从玉米（Zeamays)中分离的双向启动子。
[0006] 本发明目的之二是提供含有上述双向启动子的重组表达载体以及含有该重组表 达载体的重组宿主细胞。
[0007] 本发明目的之三是将所述的双向启动子以及含有该双向启动子的重组表达载体 应用于构建转基因植物、改良农作物性状以及培育具有优良性状的植物新品种等方面。
[0008] 为实现上述目的，本发明首先提供了从玉米（Zeamays)中分离的双向启动子，其 多核苷酸序列为（a)或（b)或（c)所示：
[0009] (a)、SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4 或SEQIDNO. 5 所示 的多核苷酸序列；或
[0010] (b)、分别与SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4 或SEQID NO. 5的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸仍具有双向启动子 的功能；或
[0011] (C)、分别与SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4 或SEQID NO. 5的多核苷酸序列至少有60 %以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有双向启 动子的功能；优选的，分别与SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4 或SEQ IDNO. 5的多核苷酸序列至少有80%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具有双向 启动子的功能；更优选的，分别与SEQIDNO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3、SEQIDNO. 4 或SEQIDNO. 5的多核苷酸序列至少有90%以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸具 有双向启动子的功能。
[0012] 本发明将SEQIDNO. 1所示的ZmBDl全长启动子从5'端开始逐渐删除部分序列得 到六个截短的启动子缺失片段，这六个启动子缺失片段的核苷酸序列分别为SEQIDNO. 7、 SEQIDNO. 8、SEQIDNO. 9、SEQIDNO. 10、SEQIDNO. 11 和SEQIDNO. 12 所示；本发明在 这6个启动子缺失片段的两端各融合一个报告基因⑶S/GFP，构建得到稳定表达的双向表 达载体；转化实验证明，这6个启动子缺失片段均能同时驱动两个报告基因在玉米幼胚中 进行稳定表达，说明这6个启动子缺失片段仍具有双向启动子的功能。
[0013] 本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的双向启动子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分 离得到的双向启动子的核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表达靶基因 的双向启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0014] 将本发明双向启动子与待转化的异源性DNA序列进行可操作的连接，即得到在植 物中双向表达异源性DNA序列的重组植物表达载体；其中待转化的异源性DNA序列数量可 以是两条，这两条待转化的异源性DNA序列以相反的方向与双向启动子可操作的连接。
[0015] 所述的重组植物表达载体中还可含有选择标记基因。
[0016] 另外，可以将本发明的双向启动子与选择标记序列可操作的连接以确定选择标记 序列的活性，所述的选择标记序列通常包括提供抗生素抗性或除草剂抗性的基因，诸如：四 环素抗性基因、潮霉素抗性基因、草苷膦或草丁膦抗性基因等。
[0017] 可以采用任何植物转化方法将本发明所构建的重组植物表达载体引入到目标植 物的细胞、组织或器官中，得到转化体；再由转化体通过植物组织培养方法再生得到完整的 植株及其无性系或其后代；所述的转化方法包括：农杆菌介导的转化、原生质体转化、Ti质 粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电穿孔法、微粒轰击等；所述的目标植物包括单子叶 植物、双子叶植物；优选的，所述的目标植物为禾本科植物，例如，可以是玉米、水稻、大麦、 小麦、高粱等农作物。
[0018] 转化实验证明，将本发明的ZmBDl(SEQIDNO.l)、ZmBD2(SEQIDNO. 2)、ZmBD3(SEQ IDNO. 3)、ZmBD4(SEQIDNO. 4)、ZmBD5(SEQIDNO. 5)分别插入载体pMedGG3 中的⑶S和 GFP之间后，ZmBDl、ZmBD2、ZmBD3、ZmBD4、ZmBD5 能双向启动⑶S和GFP表达，说明ZmBDl、 ZmBD2、ZmBD3、ZmBD4和ZmBD5均具有双向启动功能。
[0019] 当双向启动子ZmBDl(SEQIDNO. 1)两端同时各融合一个报告基因⑶S和GFP时， 它仍能同时启动这两个报告基因在转基因玉米授粉后不同时期的籽粒、成熟后的干种子和 萌发三天的胚的胚和糊粉层中表达，但在营养组织根、叶、叶鞘没有表达，这个结果与ZmBDl在其任意一端融合一个报告基因GUS的在转基因玉米中的表达情况完全一致，实验结果证 明ZmBDl是一个组织特异性强的种子特异性双向启动子。
[0020] 将ZmBDl截短后获得的六个启动子缺失片段的功能验证试验结果可见，ZmBDl双 向启动子的6个启动子缺失片段均能同时驱动两个报告基因在玉米幼胚中表达，证明这6 个启动子缺失片段仍具有双向启动子的功能。
[0021] 因此，可以将本发明所分离的双向启动子或启动子缺失片段应用于改良植物性状 (例如环境胁迫抗性，例如：抗病虫害、耐盐碱、耐高温、耐低温、耐干旱等）、培育植物新品 种等方面。
[0022] 例如，可以将本发明的双向启动子或启动子缺失片段可操作的与待转化的两个异 源性DNA序列相连接，可以指导或调控两个的异源基因在植物中进行双向表达，不仅有效 避免基因沉默现象，而且能够得到具有多个预期性状的转基因植物或植物新品种；待转化 的异源性DNA序列不受限制，可以是调苄基因、调苄基因的反义基因或者能干扰内源基因 表达的小RNA等；所述的待转录的异源DNA序列可以是来自非靶基因物种的核酸分子或基 因，或者是起源于或存在于相同