融合蛋白及其在治疗多发性硬化中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域并具体涉及融合蛋白的克隆、表达，及其医药用途。本方 面还涉及融合蛋白在治疗多发性硬化中的用途。
【背景技术】
[0002] 《发巧硬化搞巧巧病巧
[0003]多发性硬化症（multiple sclerosis, M巧是中枢神经系统（central nervous system, CN巧中常见的一种慢性自身免疫性疾病，病变W早期的脑白质脱髓銷和轴突丧失 为主要改变，引起各种症状，包括感觉改变、视觉障碍、肌肉无力、忧郁、协调与讲话困难、严 重疲劳、认知障碍、平衡障碍、体热和疼痛等，严重时可W导致活动性障碍和残疾。
[0004]MS多累及中青年人群，具有很高的致残率。流行病学研究表明，全球有约250万 人患有多发性硬化，根据国家或者特定族群不同，患病率介于每100, 000人中2人至150 人之间。80%MS患者的症状属于复发一缓解型（relapsing-remitting，RR)，表现为多次复 发和缓解，两次复发间期病情稳定，随着疾病症状的渐进性恶化，10-20年之后，约有一半的 RRMS患者会转变为继发进展型（secondaryprogressive,S巧。剩余的20%MS患者属于原 发渐进型（primaryprogressive,P巧，表现为发病后病情无缓解，呈连续渐进型恶化。
[000引大量研究表明多种免疫细胞参与了 MS的发病，包括T细胞，B细胞和巨瞻细胞等。 实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimentalautoimmuneenc巧halomyelitis, EAE)是发生 在中枢神经系统的，一种由活化T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病，是由髓銷蛋白 抗原主动免疫实验动物诱发的具有慢性、反复发作性、CNS炎性脱髓銷性特点的迟发型变态 反应性疾病，主要病理特征为血管周围炎性细胞侵润和神经髓銷反应。小鼠EAE(实验性 自身免疫性脊髓炎）模型在临床症状、生化指标、免疫及病理等诸多方面与人类MS具有 相同的特征，所W它是目前国际公认的研究MS理想动物模型（中国细胞生物学学报，34卷， 826-836 页）。
[0006] 正常生理条件下，在血脑屏障化lood-brain barrie;r，BBB)控制下，仅有极少数的 免疫细胞可W进入中枢神经系统起到免疫监视作用。但是在病毒/细菌感染或者炎症状态 下，外周的大量免疫细胞可W通过血脑屏障进入中枢神经系统CNS。炎性CD4 +T细胞侵入 CNS，使得小胶质细胞活化，并招募炎性的巨瞻细胞进入CNS，最终导致CNS的髓銷被摧毁， 少突状胶质细胞死亡，该就是EAE发病的机理。通过抑制炎性CD4 + T细胞的迁移，阻止其 进入中枢神经系统，可W有效治疗和缓解EAE和多发性硬化症。2010年，诺华公司开发了首 个治疗多发性硬化症的口服药物FTY720/Gilenya，其机理就是通过抑制CD4 + T细胞的迁移 来缓解多发性硬化症状。
[0007] 现有药物巧巧不足
[0008]MS的发病机制复杂，至今仍未完全明确，对MS的治疗也没有特殊有效的药物。由 于急性MS损伤中存在显著的炎症改变，过去30年来对于MS的治疗重点集中在抗炎方面。
[0009] 目前已有7种药物被批准用来治疗MS病人，包括格拉默（glatirameracetate, GA),重组干扰素目，那他珠单抗（natalizum油），米巧意酿（mitoxantrone)等，该些药物各 自适用于不同症状的MS，可W适当缓解复发性多发性硬化，减少部分患者的病情复发或改 善患者临床症状。但该些药物同时也存在着不少副作用，例如重组干扰素目的常见不良反 应为流感样症状，持续24~48小时，2~3个月后通常不再发生。IFN-目la可引起注射部 位红肿及疼痛、肝功能损害及严重过敏反应等，IFN-目化可引起注射部位红肿、触痛，偶引 起局部坏死、血清转氨酶轻度增高、白细胞减少或贫血。那他珠单抗可引起进行性多灶性白 质脑病（progressivemultifocalle址oenc巧halopathy，PML)。米巧意酿的常见副作用包 括恶也、壳发、白细胞减少，贫血症及也肌毒性等。因此，如何针对MS发病机制发展新的诊 断和治疗手段，研发出新的有效且副作用小的MS治疗药物，有着非常重要的科学意义。
[0010] 细胞外某质蛋白1
[0011] 细胞外基质蛋白1(extracellularmatrixproteinl，ECMl)是由间质成骨细胞系 丽7分泌的85KD大小的糖基化蛋白，最初发现于1994年。研究人员于1997年找到了位于 人类染色体lq21位的ECM1同源基因。随后的研究表明，ECM1对软骨成骨形成，内皮细胞增 生和血管发生都起到重要的调节作用。从2002年开始，研究者们陆续发现ECM1突变导致类 脂质蛋白质沉积症（lipoidproteinosis)W及在苔癖硬化症（lichensclerosus)病人体 内能产生自发性的ECM1抗体，从而导致ECM1功能的丧失和疾病的发生等，显示了ECM1基 因在皮肤病学中的重要功能，也是近年来对于ECM1研究的主要方向。但是野生型ECM1的表 达水平低，不易纯化，而且在纯化过程中可能会出现蛋白结构改变，最终导致活性丢失。目 前，对于ECM1在免疫系统疾病中的功能罕有报导。
【发明内容】
[001引针对野生型ECM1的上述问题，本发明人针对ECM1的工程表达和功能研究，构建了ECM1的融合蛋白化-ECM1，并研究证明了工程表达所得融合蛋白在治疗多发性硬化中的应 用价值。
[0013] 发明人经过研究发现，将ECM1蛋白与人IgG中的化序列融合得到的蛋白更容易 通过亲和层析的方式进行纯化，而且能够在宿主中得到适当的蛋白糖基化修饰，从而使表 达出来的蛋白保持野生型蛋白的所具有的活性和功能。在诱导小鼠自身免疫性脑脊髓炎 (EA巧模型的后期，用化-ECM1蛋白进行治疗，可W显著缓解疾病程度，表现为疾病打分值 降低，浸润到中枢神经系统的炎性细胞数目减少，病理损伤减轻。深入研究表明化-ECM1抑 制致病性化细胞向CNS的迁移。目前针对MS疾病所使用的药物多为合成型，存在着各种 不同的副作用，而ECM1蛋白由化2细胞特异性高表达，其结构组成是人类在生理状态下都 存在的天然蛋白，我们预期它对人体的副作用可能较小。对化-ECM1的研究为EAE模型及 人类多发性硬化症的发病机理和治疗提供新的理论依据，化-ECM1蛋白具有进一步开发成 治疗多发性硬化药物的潜在价值。
[0014] 本发明的一个主要目的是提供一种能有效工程表达的化-ECM1融合蛋白，该蛋白 易于纯化，并能维持正常ECM1蛋白功能和活性。
[0015] 在一种实施方式中，本发明提供细胞外基质蛋白UECM1)和人IgG中化序列的融 合蛋白化-ECM1。具体地，本发明的融合蛋白中，所述细胞外基质蛋白1的氨基酸序列如SEQ IDNO. 2的41-580位氨基酸所示，所述化序列的氨基酸序列如SEQIDNO. 2的583-811位 氨基酸所示。在一种【具体实施方式】中，所述融合蛋白的序列如SEQIDNO. 2的41-811位氨 基酸所示。
[0016]在另一种实施方式中，本发明提供一种核酸，其含有化-ECM1融合蛋白的编码核 酸。具体地，所述核酸分子含有编码细胞外基质蛋白1的核巧酸序列，例如但不限于SEQ IDNO. 1的121-1740位核巧酸，W及编码所述化序列的核巧酸序列，例如但不限于SEQID NO. 1的1747-2433位核巧酸。可选地，所述核酸还含有信号肤序列的编码核巧酸序列，包括 但不限于SEQIDN0.2的2-40位氨基酸所示昆虫信号肤的编码核巧酸序列，例如但不限于 SEQIDNO. 1的4-120位核巧酸。在一种【具体实施方式】中，所述核酸的序列如SEQIDNO. 1 的 1-2436 位、4-2436 位、1-2433 位、4-2433 位、121-2436 位或 121-2433 位核巧酸所示。
[0017] 在另一种实施方式中，本发明提供一种表达载体，用W表达化-ECM1融合蛋白。在 一种【具体实施方式】中，所述表达载体含有化-ECM1融合蛋白的编码核酸。在另一种实施方 式中，本发明提供一种表达化-ECM1融合蛋白的宿主细胞。在一种【具体实施方式】中，所述宿 主细胞为昆虫细胞真核表达系统，如昆虫杆状病毒表达系统。
[0018] 本发明的一个主要目的是提供一种用于治疗多发性硬化的药物组合物。在一种实 施方式中，所述药物组合物包含（A)治疗有效量的细胞外基质蛋白1 及炬）药学上或免 疫学上可接受的运载体或赋形剂。在一种【具体实施方式】中，所述药物组合物中细胞外基质 蛋白1占药物组合物总重量的0. 001~99. 9wt%。在一个优选实施方式中，所述药物组合 物中细胞外基质蛋白1占药物组合物总重量的1~95wt%，优选为5~90wt%，更优选10~ 80wt%。在一种【具体实施方式】中，所述运载体包括但不限于水、水性缓冲液、己醇、多元醇、 植物油、可注射有机醋，及其混合物。具体地，所述水性缓冲液包括但不限于下组：磯酸盐缓 冲液、Tris缓冲液、测酸盐缓冲液、玻巧酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或巧樣酸盐缓冲液。
[0019] 本发明的另一个主要目的是提供一种治疗多发性硬化的方法，所述方法包括将治 疗有效量的化-ECM1融合蛋白给予需要获得治疗或缓解的对象。可W将所述化-ECM1融合 蛋白W药物组合物的形式给予对象。所述对象可W是哺乳动物，例如人。所述方法可W通 过抑制T细胞的迁移来治疗或缓解多发性硬化。
[0020] 本发明的另一个主要目的是提供细胞外基质蛋白1在药物制备中的用途，所述药 物用于治疗或缓解多发性硬化。
[0021] 在一些实施方式中，本发明所述的药物组合物或方法能够有效治疗多发性硬化或 缓解其症状，所述症状包括但不限于下组：感觉改变、视觉障碍、肌肉无力、忧郁、协调与讲 话困难、严重疲劳、认知障碍、平衡障碍、体热、疼痛、活动性障碍和残疾等。
[0022] 在一些实施方式中，本发明所述的药物组合物或方法中，可将所述化-ECM1融合 蛋白与水性和非水性载体混合用于给药或制备药物组合物。用于治疗应用的药学上可接受 的运载体是药学领域众所周知的。所述运载体可包括但不限于：水、水性缓冲液、己醇、多元 醇（如甘油、丙二醇、聚己二醇等）和它们的合适混合物，植物油如橄揽油，W及可注射有机 醋如油酸己醋等。所述水性缓冲液包括但不限于；磯酸盐缓冲液、Tris缓冲液、测酸盐缓冲 液、玻巧酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或巧樣酸盐缓冲液等。
[0023]在一些实施方式中，本发明所述的细胞外基质蛋白1可W通过口服、注射、局部 给予或与其它已知技术来给予对象。所述注射包括但不限于；皮下注射、静脉内注射、腹 膜内、肌肉内注射、胸骨内注射和输注。可W将有效量的细胞外基质蛋白1通过单次给予 或或多次给予提供给对象，例如每日一次、隔日一次、H日一次、每周两次、每周一次、每月 两次、每月一次等。在某些实施方式中，该细胞外基质蛋白1的给药剂量为约60mg/kg至 0. 025mg/kg，更优选约0. 025mg/kg至15mg/kg，例如4mg/kg或5mg/kg。本领域技术人员可 采用已知技术根据治疗的目的和所需实现的治疗效果来确定确切的剂量和制剂，参见例 女口，Remington:TheScienceandPracticeof化arma巧（《雷明顿；药物科学和实践》）， Gennaro编（2003 年第 20 版），和Pickar，DosageCalculations(《剂量计算》）（1999)) 等。
[0024] 基于本文的公开内容，本发明的其它方面对本领域技术人员而言是显而易见的。
[00巧]附图简要说明
[0026] 图1显示纯化蛋白的考马斯亮蓝染色图。