一种抗小反刍兽特异性IgY的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗小反刍兽特异性IgY的制备方法。
【背景技术】
[0002]小反合兽疫(Peste des petits nlrninants，PPR)俗称羊瘟，又名小反合兽假性牛瘟(pseudorinderpest)、肺肠炎(pneumoenteritis)、口炎肺肠炎复合症(stomatitis-pneumoenteritis complex)，是A类烈性传染病，是由小反合兽疫病毒引起的一种严重的烈性、接触性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。主要感染小反刍兽，特别是山羊高度易感。
[0003]目前对PPR尚元特效的治疗方法。对于发病的动物使用抗生素和磺氨类药物对症治疗可以防止细菌的继发感染。用高免血清进行被动免疫在疫病发生时减少疫病的传播，但是对已经发病的病畜无作用。目前防制PPR，主要是依赖于疫苗的免疫接种，耐过PPR的绵羊和山羊会产生主动免疫。根据PPH病毒和RP病毒的抗原相关性，可用RP组织培养疫苗来对绵羊和山羊进行PPR免疫。Bourdin等首次报道使用细胞培养的RP弱毒疫苗免疫山羊防制PPR，产生的抗RP抗体能够抵抗PPR病的攻击，而且对于新生羔羊和怀孕母羊无致病性，具有良好的保护作用，西非某些地区用此成功地控制了 PPR。Ndulaka等用感染山羊的病理组织制备同源的PPR灭活疫苗，用甲醛灭活制备的效果不佳，而用氯仿灭活制备的疫苗，其有效期4°C可保护I年，免疫山羊后血清抗体可以持续8个月。Jones L等用基因重组技术，成功的同时表达了 RPV的F基因和H基因制备了重组疫苗免疫山羊。虽然产生的是抗RPV的抗体(中和抗体和ELISA抗体)，无抗PPRV的抗体，但用PPR病毒攻击，全部获得保护。同时也提示了可能是由于存在细胞免疫，重组的H蛋白产生抗RPV的中和抗体，而表达的F蛋白无抗体产生，二者都无抗PPRV的抗体产生。
[0004]为了克服应用牛瘟疫苗预防PPR影响对RP血清监控的问题，同时也为了使制备RP疫苗对PPR更有效，研宄者应用反向遗传技术制备RPV/PPRV嵌台体疫苗，应用PPRV的糖蛋白基因替代RPV疫苗表面相应的糖蛋白基因。这种嵌合体疫苗对PPRV产生良好的免疫原性，并且免疫动物血清中无特异的RP病毒ELISA抗体。研宄小组目前正在构建3种嵌合体疫苗，用PPRV的F蛋白和H蛋白分别单独或二者同时替代RPV疫苗基因组中的相应蛋白，期望这种疫苗能与自然感染RPV或PPRV产生的抗体和区别，这将有助于对野外存在的这两种疫病进行血清学监控。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种抗小反刍兽特异性IgY的制备方法，以便用于小反刍兽疫病检测与治疗。
[0006]本发明具体通过以下技术方案实现:
[0007]一种抗小反刍兽特异性IgY的制备方法，通过以下步骤完成:
[0008]I)量取小反刍兽疫病毒灭活苗，加入等体积的免疫佐剂，选取生产状态良好的70?80日龄未开产母鸡进行免疫；
[0009]2)收集鸡蛋进行消毒，4°C冰箱存储不多于45天，使用苯扎溴铵溶液进行表面清洗，烘干后收集卵黄，将卵黄使用无菌NaCl溶液进行稀释；
[0010]3)向稀释液加入PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用20?30分钟；
[0011]4)离心分离，收集上清，过滤，滤液加入PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用20?30分钟；
[0012]5)离心分离，弃去上清液，沉淀使用1mL的无菌溶液NaCl溶液悬浮，加入PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用20?30分钟，进行离心，获得沉淀物；
[0013]6)将沉淀物使用1.2?1.5mlNaCl溶液溶解，使用透析带进行透析，收集IgY，并保存在_20°C备用。
[0014]所述的免疫佐剂由氢氧化铝和蜂胶组成，氢氧化铝和蜂胶组成的重量比为4?9:1。
[0015]步骤(I)中免疫方法为免疫注射，分为胸肌、腿肌各两点肌注免疫，初次免疫30天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为15?30天，免疫剂量为200?1000 μ g/kg。
[0016]所述的苯扎溴铵溶液的质量浓度为10?50g/L。
[0017]所述的卵黄与NaCl溶液的体积比为1:1?4。
[0018]步骤(3)中所述的PEG-6000与稀释液的质量体积比为25?50g/L。
[0019]步骤(4)中所述的PEG-6000与滤液的质量体积比为60?90g/L。
[0020]步骤(5)中所述的PEG-6000与悬浮液的质量体积比为100?130g/L。
[0021]步骤(6)中透析具体方法为使用I X PBS (pH = 7.2?7.5)透析过夜，次日凌晨换用 0.5 X PBS (pH = 7.4)，12 ?14h 后，用 0.1 X PBS (pH = 7.0)透析 6 ?1h0
[0022]本发明所属的NaCl溶液质量浓度为500?900g/L。
[0023]本发明所述的IgY抗体经包含两条链，重链为65ku和轻链为19ku。
[0024]本发明的有益效果为:本发明提取的抗E2_IgY抗体可较好地结合E2蛋白，而与降解片段无交叉反应；提取方法相对简单，抗体产量大，制备成本低。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0026]实施例1
[0027]一种抗小反刍兽疫病毒特异性IgY的制备方法，所述方法包括以下步骤:
[0028]1、免疫原制备及免疫
[0029]量取小反刍兽疫病毒灭活苗溶液，加入等体积的免疫佐剂(氢氧化铝:蜂胶=4?9:1)，进行乳化，待其形成良好的油包水型，选取生产状态良好的80日龄未开产母鸡5只，进行初次免疫注射，免疫剂量为200?1000 μ g/kg，分为胸肌、腿肌左右各两点肌注免疫，初次免疫30天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为15?30天，免疫剂量为200?1000 μ g/kg,最后一次使用弗氏不完全佐剂进行加强免疫。待母鸡开产后，收集免疫鸡蛋，新洁尔灭消毒，标号，4°C保存(不多于45天)。
[0030]2、IgY抗体提取与鉴定
[0031]改良的聚乙二醇(PEG-6000)沉淀法提取IgY抗体，操作步骤如下:
[0032]I)将所述收集的蛋，使用新洁尔灭(0.01?0.05W/V)进行表面清洗，烘干后分离器分离卵黄与蛋清；
[0033]2)卵黄和无菌生理盐水(NaCl 0.5?0.9W/V)缓冲液1:4混合，涡旋，充分混匀；
[0034]3)加入3.5% (W/V，下同)的PEG-6000，涡旋混合，摇床上室温作用10?30min ；
[0035]4)离心(10000rpm，4°C，20min，下同)后，出现分层，由上而下为黄色脂肪层、清亮层(IgY)和半固体层;
[0036]5)液体经滤纸过滤，弃去沉淀物，记录所得滤液体积，加6 %?9 % PEG-6000，摇床上室温作用10?30min ；
[0037]6)离心，如上，弃去上清液，沉淀物加1ml NaCl (0.5?0.9W/V)溶解，加12%(1.2g)PEG 6000，在摇床上室温作用10?30min ；
[0038]7)离心，如上，弃去上清液，沉淀物加1.2ml NaCl溶解；
[0039]8)将所述沉淀物使用1.2?1.5毫升NaCl (0.5?0.9W/V)溶解后，使用透析带进行透析，使用I XPBS (pH =