构建hiv病毒抗体酵母展示库的方法和筛选病毒广谱中和性抗体的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法和筛 选病毒广谱中和性抗体的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 广谱病毒中和抗体是感染病人获得性免疫球蛋白，此类抗体广谱的与病毒颗粒结 合，阻止其进一步感染人体细胞，可导致病毒颗粒裂解，进而引起"中和"反应。尤其在易突 变的病毒，譬如HIV治疗中及其重要。目前筛选病毒广谱中和抗体，多利用病人外周血单个 核淋己细胞PBMC细胞，进行抗体DNA的扩增，利用瞻菌体展示进行顺次反复筛选，建立瞻菌 体展示的抗体库。
[000引但是，由于中和性抗体的比例小，且极其稀有，若筛选压力不足，很难从108-10 9库 容量的库中获得阳性克隆，假阳性高。若筛选压力过大，容易丢失亲和力低但中和性强的抗 体株。因此，瞻菌体筛选的缺点是假阳性率高，且筛选过程不易控制，容易造成有效克隆丢 失。
[0004] 因此有必要提供一种高效、假阳性率低、且筛选过程可控的筛选病毒广谱中和性 抗体的方法。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法， 该方法通过构建酵母抗体展示库，采用英光标记的病毒抗原蛋白，结合流式细胞仪分选技 术筛选病毒广谱中和性抗体，该流式分选过程为可视化筛选，通过设置细胞分离口，提高了 筛选过程的可控性，避免了常规筛选带来的假阳性过高问题。本发明第二方面提供了一种 筛选病毒广谱中和性抗体的方法的应用。本发明第H方面提供了一种构建HIV病毒抗体 酵母展示库的方法。本发明第四方面提供了一种构建HIV病毒抗体酵母展示库的方法的应 用。
[0006] 本发明所述"单个核淋己细胞"是指W淋己细胞为主的细胞群体，其中含有少量的 单核细胞。VH代表抗体重链，化代表抗体轻链。
[0007] 第一方面，本发明提供了一种筛选病毒广谱中和性抗体的方法，包括如下步骤： [000引（1)提供病毒抗原蛋白；
[0009] (2)采用英光标记物对所述病毒抗原蛋白进行标记；
[0010] (3)制备病毒阳性病人的cDNA模板，设计引物，扩增抗体基因；
[0011] (4)采用所得抗体基因构建酵母抗体展示库；
[0012] (5)取所得抗体展示库中的酵母细胞与步骤（2)所得具有英光标记物的病毒抗原 蛋白混合赔育，然后设定细胞分离口，采用流式细胞仪分选英光阳性的酵母细胞；
[0013] (6)对所得英光阳性的酵母细胞进行测序鉴定，得到病毒广谱中和性抗体。
[0014] 优选地，所述步骤（1)中，所述病毒抗原蛋白为HIV-1型病毒的抗原蛋白。
[0015] 进一步优选地，所述HIV-1型病毒为HIV-1病毒A、B、B'、C、D、G和F亚型中的至 少一种。
[0016] 进一步优选地，3、4、所述HIV-1型病毒的抗原蛋白为HIV-1型病毒的甜41抗原蛋 白、甜120抗原蛋白和甜160抗原蛋白中的一种或多种。
[0017] 优选地，所述步骤（2)中，所述采用英光标记物对所述病毒抗原蛋白进行标记的步 骤为采用不同的英光标记物对不同的所述病毒抗原蛋白分别进行标记。
[0018] 进一步优选地，所述不同的英光标记物为AlexaFluor# 488、AlexaFluo;r555和 AlexaFluor647中的一种或多种。
[0019] 优选地，所述步骤（3)中，所述制备病毒阳性病人的cDNA模板的步骤为：制备或 提供HIV-1阳性病人外周血单个核淋己细胞PBMC，提取总RNA，W随机六聚体为引物反转录 合成cDNA。
[0020] 所述设计引物的步骤包括：
[00川a、合成第一轮PCR引物
[002引包括VH上游引物、VH下游引物、VL上游引物、VL下游引物，各引物不含酶切位点 和linker序列；
[002引 b、合成第二轮PCR引物
[0024]将每条第一轮PCR引物的5'端加上linker序列，得到第二轮PCR引物，其中，加 在VH的上游引物和化的下游引物的5'端的linker序列中各有一个SfiI酶切位点，加 在VH的下游引物和化的上游引物的5'端的linker序列反向互补；
[00巧]所述扩增抗体基因的步骤包括：
[0026] SOI、多重PCR扩增抗体重链：
[0027]W所得cDNA为模板，取第一轮PCR引物的重链下游引物等摩尔混合，再分别与重 链上游引物进行多重PCR，得到第一轮重链PCR产物；然后W第二轮PCR引物的重链上游引 物等摩尔混合，再分别与重链下游引物进行第二轮多重PCR，得到第二轮重链PCR产物；
[0028]S02、多重PCR扩增抗体轻链：
[002引 W所得cDNA为模板，取第一轮PCR引物的轻链下游引物等摩尔混合，再分别与轻 链上游引物进行多重PCR，得到第一轮轻链PCR产物；然后W第二轮PCR引物的轻链上游引 物等摩尔混合，再分别与轻链下游引物进行第二轮多重PCR，得到第二轮轻链PCR产物；
[0030]S03、将步骤SOI所得的第二轮重链PCR产物和S02所得的第二轮轻链PCR产物混 合进行重叠PCR，得到抗体基因。
[0031] 进一步优选地，所述设计引物的步骤中，所述化包括VK和VA链。
[0032] 进一步优选地，所述设计引物的步骤中，所述VH上游引物、VH下游引物、VK上游 引物、W及VK下游引物分别有9条、4条、6条W及5条。
[0033] 更进一步优选地，所述9条VH上游引物分别为核巧酸序列如SEQIDNO: 1~9所 示的DNA分子。
[0034] 更进一步优选地，所述4条VH下游引物分别为核巧酸序列如SEQIDNO: 10~13 所示的DM分子。
[003引更进一步优选地，所述6条VK上游引物分别为核巧酸序列如SEQIDNO: 14~19 所示的DM分子。
[0036] 更进一步优选地，所述5条Vk下游引物分别为核巧酸序列如SEQIDN0:20~14 所示的DM分子。
[0037] 设计第二轮PCR引物时，加在VH的下游引物和化的上游引物的5'端的linker 序列反向互补，用W通过重叠PCR获得VH和化依次相连的抗体基因（ScFv)。
[003引进一步优选地，所述linker序列的核巧酸序列分别如SEQIDNO:25~28所示， 其中，每条VH上游引物的5'端加上核巧酸序列如SEQIDN0:25所示的Linker,每条VH下 游引物的5'端加上核巧酸序列如SEQIDNO: 26所示的Linker,每条化上游引物的5'端 加上核巧酸序列如SEQIDNO: 27所示的Linker,在每条化下游引物的5'端加上核巧酸序 列如SEQIDNO:28 所示的Linker。
[0039] 在此优选情况下，本发明先采用多重PCR扩增抗体的重链（VH)和轻链（VL)，再通 过重叠PCR将重链和轻链进行拼接，从而获得ScFv基因，具体步骤包括；首先W第1链cDNA (即RNA逆转录所得cDNA)为模板，通过1stPCR上游引物的混合引物和单条下游引物分别 进行多重PCR，获得1stPCR产物，回收PCR产物。再WistPCR产物为模板，2ndPCR的引 物分别进行第二轮多重PCR，分别获得化dPCR产物，琼脂糖电泳回收并合并化dPCR产物， 形成化dVHmix和化dVLmix。W化dVHmix和化dVLmix为模板，通过重叠PCR将其拼 接成ScFv。
[0040] 优选地，所述重叠PCR的步骤为：
[00川 先W化dVHmix和化dVLmix为模板，无引物运行PCR2~3个循环，再加入VH 上游引物的linkerW及化下游引物的li