7.2?7.5)透析过夜，次日凌晨换用0.5 XPBS (pH = 7.4)，12?14h后，用0.1 XPBS (pH = 7.0)透析6?10h，收集IgY，并保存在_20°C备用。
[0040]提纯IgY抗体经SDS-PAGE电泳分析，以鉴定IgY抗体提取纯度。
[0041]实施例2IgY抗体效价的监测
[0042]1、间接ELISA法测定抗BVDV_E2IgY抗体效价，操作步骤如下:
[0043]I)重组蛋白使用包被缓冲液(CBS，pH 9.0)进行稀释(10 μ g/ml)，100 μ L/孔进行包被，4°C孵育过夜；
[0044]2) PBST-20 洗涤 3 次，5min/ 次；
[0045]3)加入封闭缓冲液(2% PBS-BSA) 200 μ L/ 孔，37°C 封闭 2h ；
[0046]4) PBST-20 洗涤，同上；
[0047]5) IgY抗体使用PBSM，倍比稀释1:1000,直至1:128000 ;非特异性IgY抗体，PBS (pH7.2)分别作为阴性和空白对照，37°C孵育Ih ；
[0048]6) PBST-20 洗涤，同上；
[0049]7)加HRP标记的山羊抗鸡的抗体(1:5000)，37°C孵育Ih ；
[0050]8) PBST 洗涤，同上；
[0051]9)每孔加入 100 μ L 显色液(1mL 底物缓冲液，150 μ L TMB, 30 μ L 的 Η202)，37°C作用15min ；
[0052]10)每孔加入50 μ L的2Μ H2S04进行终止，读值0D450。
[0053]2、IgY 抗体 Western blot 鉴定
[0054]SDS-PAGE电泳分小反合兽疫病毒蛋白，转膜后进行Western blot鉴定，方法如上。IgY抗体作为一抗，1:2000稀释，HRP标记的羊抗鸡二抗进行稀释，稀释度为1:6000。操作如下:
[0055]I)转膜前准备:凝胶使用去离子水漂洗后，置于转移缓冲液中。戴上手套，使用刀片分别裁剪与凝胶长、宽相同的6张滤纸，I张PVDF膜。将PVDF膜置于甲醇(100%)中浸泡，与6张滤纸一起浸于转移缓冲液平衡。
[0056]2)转膜:按照3张滤纸、PVDF膜、凝胶、3张滤纸的顺序，将其叠放于半干转移装置的石墨板上，PVDF膜置于正极。使用玻璃棒除去膜与膜，膜与胶之间的气泡，在滤纸上加入Iml转移缓冲液，进行转移，转移参数:2V，100mA, 50min左右。转膜后的凝胶转移至盛有考马斯亮蓝染液的托盘中，进行染色，以检查蛋白质转移是否完全，同时切去滤膜的左下角作为标记。
[0057]3)封闭:带上手套，将PVDF膜置于可加热封接的塑料袋中，加入1ml封闭缓冲液(0.1ml/cm2)，排除气泡，摇床上室温温育I小时。
[0058]4) 一抗和靶蛋白的结合:弃去封闭液，加入封闭缓冲液稀释的抗小反刍兽疫病毒蛋白IgY为一抗(1:5000)，排除气泡后密封袋口，平放于摇床，室温温育1-2小时。
[0059]5)洗膜:剪开塑料袋，弃去封闭液和抗体，TBST漂洗PVDF膜3次，每次10分钟。
[0060]6) 二抗和一抗的结合:经TBST最后一次洗涤后，把PVDF膜转移至塑料袋，按滤膜面积加入封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡二抗(I: 5000)，37°C平缓摇动、温育I小时。
[0061 ] 7)洗涤:将PVDF膜转移至TBST溶液，室温洗涤3次，1min/次。
[0062]8)显色:暗室中，将鲁米唑和双氧水按照1:1比例混合，制成发光液。将PVDF膜置于发光液进行显色，直至条带清晰后，使用镊子拿出，置于蒸馏水中漂洗，放到定影液中，定影5min。
[0063]3、结果
[0064]I) IgY抗体的提取及鉴定
[0065]提纯IgY经SDS-PAGE电泳后，主要包括两条带，65ku和19ku，且在40ku附近出现低分子量片段，表明用PEG-6000经过三次浓度梯度的纯化，其纯度很高。
[0066]2) ELISA 效价测定
[0067]抗小反刍兽疫病毒特异性IgY抗体，使用间接ELISA测定，抗体效价在开始产蛋便可达到1:24000，随后缓慢降低，待加强免疫后，效价继续升高，最后效价达到1:40560。
[0068]3) Western blot 鉴定
[0069]重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，进行转膜，使用抗小反刍兽疫病毒IgY抗体作为一抗，检测抗体特异性。结果表明，提取的抗小反刍兽疫病毒IgY抗体可较好地结合小反刍兽疫，而与降解片段无交叉反应。
【主权项】
1.一种抗小反刍兽特异性IgY的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)量取小反刍兽疫病毒灭活苗，加入等体积的免疫佐剂，选取生产状态良好的70?80日龄未开产母鸡进行免疫； 2)收集鸡蛋进行消毒，4°C冰箱存储不多于45天，使用苯扎溴铵溶液进行表面清洗，烘干后收集卵黄，将卵黄使用无菌NaCl溶液进行稀释； 3)向稀释液加入PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用20?30分钟； 4)离心分离，收集上清，过滤，滤液加入PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用20?30分钟； 5)离心分离，弃去上清液，沉淀使用1mL的无菌溶液NaCl溶液悬浮，加入PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用20?30分钟，进行离心，获得沉淀物； 6)将沉淀物使用1.2?1.5mlNaCl溶液溶解，使用透析带进行透析，收集IgY，并保存在-20 °C备用。
2.根据权利要求1所述的一种抗小反刍兽特异性IgY的制备方法，其特征在于:步骤(I)中免疫方法为免疫注射，分为胸肌、腿肌各两点肌注免疫，初次免疫30天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为15?30天，免疫剂量为200?1000 μ g/kg。
3.根据权利要求1所述的一种抗小反刍兽特异性IgY的制备方法，其特征在于: 步骤(3)中所述的PEG-6000与稀释液的质量体积比为25?50g/L ； 步骤(4)中所述的PEG-6000与滤液的质量体积比为60?90g/L ； 步骤(5)中所述的PEG-6000与悬浮液的质量体积比为100?130g/L。
4.根据权利要求1所述的一种抗小反刍兽特异性IgY的制备方法，其特征在于:步骤(6)中透析具体方法为使用pH7.2?7.5的I XPBS透析过夜，次日凌晨换用pH7.4的0.5XPBS, 12 ?14h 后，用 ρΗ7.0 的 0.1 XPBS 透析 6 ?1h0
5.根据权利要求1所述的一种抗小反刍兽特异性IgY的制备方法，其特征在于:所述的卵黄与NaCl溶液的体积比为1:1?4。
6.根据权利要求1所述的一种抗小反刍兽特异性IgY的制备方法，其特征在于: 所述的苯扎溴铵溶液的质量浓度为10?50g/L ； 所述的NaCl溶液的质量浓度为500?900g/L。
【专利摘要】一种抗小反刍兽特异性IgY的制备方法，量取小反刍兽疫病毒灭活苗，加入等体积的免疫佐剂，小反刍兽疫病毒灭活苗免疫70～80日龄的母鸡，使用改良的PEG6000沉淀法提取特异性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析，ELISA效价监测，Western blotting特异性分析。本发明提取的抗小反刍兽疫病毒的IgY抗体可较好地结合与小反刍兽疫病毒发生反应，而与降解片段无交叉反应。
【IPC分类】C07K16-02, C07K16-10
【公开号】CN104725502
【申请号】CN201510057309
【发明人】张小莺, 黄光东, 敬晓棋, 胡小宏, 高世宏, 黄广争, 张琼, 陈生叶, 安加俊, 黄广磊, 张树猛
【申请人】陕西溯源农业发展有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年2月4日