一种红鳍东方鲀神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体及其应用
【专利说明】-种红韓东方纯神经坏死病毒衣亮蛋白卵黄抗体及其应用 发明领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种红罐东方鈍神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄 抗体及其应用。 技术背景
[0002] 神经坏死病毒（Nervousnecrosisvirus,NNV)是一种在世界范围内流行的鱼类 病原，流行在中国大陆、台湾地区、日本、澳大利亚、英国、加拿大、挪威等国家和地区，可造 成30多种重要经济鱼类的稚鱼、仔鱼甚至石斑鱼成鱼大规模死亡，严重危害着鱼类的健康 养殖。此病毒病的研究是国际水产病害的研究热点。神经坏死病毒分类上属于野田村病 毒科（Nodaviridae)，己型野田村病毒属炬etanodavirus)。病毒粒子直径约30-40纳米， 二十面体，无囊膜。神经坏死病毒为单一正链、2节段RNA病毒。病毒基因组由RNA1和RNA2 组成。RNA1编码病毒RNA聚合酶；RNA2编码衣壳蛋白，也是病毒的唯一结构蛋白，和病毒 感染密切相关，是研究病毒疫苗的重要蛋白。神经坏死病毒主要感染鱼苗，患病鱼类在脑 部和视网膜可见明显的空泡，可导致鱼苗死亡率达90%W上。目前对此病毒病还没有特效 药物可W治疗，疫苗是防治此类疾病的重要手段。但是到目前为止，还没有商品化的疫苗。 专利CN200410027186公开了一种神经坏死病毒重组蛋白疫苗，但是该疫苗存在W下不足： (1)神经坏死病毒感染鱼类是在稚鱼期，此时稚鱼还没有产生抗体的能力，因此此类疫苗无 法在稚鱼期使用，因此应用价值不大；（2)该种疫苗需要靠注射来防疫，相对于人类和畜牧 而言，由于鱼苗较小，生活在水中，注射免疫法耗时，操作不便，因而大大限制了该疫苗的商 品化推广。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种红罐东方鈍神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体及其应 用。
[0004] 为解决W上技术问题，本发明采用W下技术方案：
[0005] 一种红罐东方鈍神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体，由下述方法制备得到：
[0006] (1)通过RT-PCR方法克隆红罐东方鈍神经坏死病毒衣壳蛋白基因的DNA，然后重 组到谷脱甘肤S-转移酶融合基因表达载体pGEX-5x-l中，构建成pGEX-5x-l-CP重组质粒， 所述PGEX-5X-1-CP重组质粒中含有谷脱甘肤S-转移酶和神经坏死病毒衣壳蛋白的融合 基因；
[0007] (2)重组质粒pGEX-5x-l-CP在大肠杆菌中的表达：将pGEX-5x-l-CP重组质粒转 化大肠杆菌，次日挑选转化平板上的大肠杆菌单菌落于含有氨节青霉素的培养基中扩大培 养，利用IPTG诱导谷脱甘肤S-转移酶（GST)和神经坏死病毒衣壳蛋白的融合基因在大肠 杆菌中表达；收集菌体，采用包涵体提纯技术提取并纯化得到GST-CP重组蛋白；
[000引 （3)用GST-CP重组蛋白免疫产蛋母鸡，收集免疫母鸡所产鸡蛋，从所收集的鸡蛋 中提取并纯化卵黄抗体。
[0009] 按上述方案，所述GST-CP重组蛋白的分子量大小为66kDa~68kDa。
[0010] 按上述方案，所述RT-PCR方法为；W红罐东方鈍神经坏死病毒为模板，采用特异 性引物将红罐东方鈍神经坏死病毒衣壳蛋白基因反转录成第一链cDNA，再PCR扩增得到双 链cDNA。
[0011] 按上述方案，所述pGEX-5x-l-CP重组质粒的构建方法为：将cDNA和pGEX-5x-l载 体分别进行双酶切，再进行连接反应得到含有谷脱甘肤S-转移酶和神经坏死病毒衣壳蛋 白的融合基因的pGEX-5x-l-CP重组质粒。
[0012] 按上述方案，所述重组质粒pGEX-5x-l-CP在大肠杆菌中的表达为；pGEX-5x-l-CP 重组质粒转化大肠杆菌，次日挑选转化平板上的单菌落于含有氨节青霉素的LB液体培养 基中，于37°C、200转/分钟进行恒温摇床培养，当大肠杆菌的OD值达到0. 4~0.6时，加 入终浓度为Immol/L的IPTG，在25~37°C诱导4~8小时。
[0013] 按上述方案，所述免疫为两翅及两侧胸肌注射。
[0014] 按上述方案，所述免疫的次数为3次，每次免疫的时间间隔为2周。
[0015] 按上述方案，所述免疫方式为；首次免疫注射由GST-CP重组蛋白与等体积完全弗 氏佐剂乳化成的疫苗，第二次及第S次免疫注射由GST-CP重组蛋白与不完全弗氏佐剂乳 化成的疫苗。
[0016] 按上述方案，步骤（3)所述从鸡蛋中提取并纯化卵黄抗体的方法为；将所收集鸡 蛋的蛋清和蛋黄分离，取蛋黄，去掉卵黄膜，然后加入灭菌蒸馈水，充分摇匀、置于4°C条件 下过夜后，收集上清即为卵黄抗体。
[0017] 上述红罐东方鈍神经坏死病毒衣壳蛋白卵黄抗体在制备鱼用抗神经坏死病毒疫 苗制品中的应用。
[001引本发明的有益效果；本发明方法制备得到的卵黄抗体表达持续稳定，经中和试验 证实，本发明所制备的卵黄抗体能够有效抑制红罐东方鈍神经坏死病毒，效价高，具有良好 的免疫保护效力，可W在鱼类的稚鱼期，将其作为抗神经坏死病毒疫苗添加到鱼类饲料中， 为鱼类神经坏死病毒疫苗的商品化推广提供了可能性，具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0019] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的 内容不仅仅局限于下面的实施例。
[0020] 实施例1 ;红罐东方鈍神经坏死病毒衣壳蛋白基因pGEX-5x-1-CP重组质粒的构建
[0021]W红罐东方鈍神经坏死病毒感染的鱼类细胞提取的总RNA为模板，采用下游引物 CP-No11-BW:GATGCGGCCGCTTAGTTTCCCGAGTCAACCC，将红罐东方鈍神经坏死病毒衣壳蛋白基 因进行RT-PCR反应生成第一链cDNA，RT-PCR反应的试剂为：反转录酶、dNTP、缓冲液；条件 为；75°C，5min;42°C，1小时；80°C，lOmin。随后，将获得的cDNA作为模板，使用上游引物 CP-SalI-FW: 5 ' -GGTCGACTCATGGTACGCAAGGGTGATAAG-3 ' 和下游引物CP-No11-BW:GATGCGGCC GCTTAGTTTCCCGAGTCAACCC，PCR扩增得到双链DM。PCR反应的试剂为；高保真DM聚合酶、 dNTP、缓冲液；PCR扩增反应条件为；预变性95°C5min;随后95°C，40s;6rC，40s;72°C，1 min;共35个循环，随后在72°C延伸5min，4°C保存。将反应产物在1%的琼脂糖上电泳分 离，提纯目的DNA片段。随后将提纯的DNA片段和pGEX-5x-l载体分别用Sail和Notl双 酶切，用T4DNA连接酶将酶切的DM片段连接到酶切的pGEX-5x-l载体上，获得到含有GST和神经坏死病毒衣壳蛋白融合基因的pGEX-5x-l-CP重组质粒。所述连接反应体系为；DM 2y1，pGEX-5x-16y1，10X连接缓冲液 2y1，TJ)NA连接酶 1y1，16°C，30 分钟。
[0022] 实施例2 ;重组质粒pGEX-5x-l-CP在大肠杆菌中的表达
[0023] 将PGEX-5X-1-CP重组质粒转化大肠杆菌，次日挑选转化平板上的单菌落于含有 氨节青霉素的LB液体培养基中，于37°C、200转/分钟进行恒温摇床培养，当大肠