新型il23拮抗剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，设及一种能够结合IL-23并括抗其作用的IL-23受体 胞外区片段/Fc融合蛋白、该融合蛋白稳定表达细胞株W及该融合蛋白对WThl7细胞异常 激活为特征的疾病的治疗。
【背景技术】
[0002] 化17细胞是T细胞分化发育过程中一种特殊的细胞亚群，通过分泌特征性细胞 因子IL-17发挥免疫学功能，与自身免疫性疾病的发病和宿主抵抗胞外细菌感染等密切相 关。比-17是一种促炎症细胞因子，可W募集和活化中性粒细胞，诱导其他炎症因子表达， 介导炎症细胞在病灶部位的浸润并最终引发组织损伤。研究表明，不少自身免疫性疾病患 者体内存在化17细胞不适当的激活和功能的失衡，表现为化17细胞，比-17W及转录因子 R0R丫t异常上调，因此如果能有效阻断患者体内化17细胞的分化、扩增W及相关细胞因子 的表达则可预防、延缓甚至阻止自身免疫性疾病的发生、发展。已经有大量临床实验研究发 现抑制化17细胞的功能，能够显著改善类风湿性关节炎、多发性硬化症、炎性肠炎、系统性 红斑狼疮和银屑病等自身免疫性疾病症状。除了自身免疫性疾病，还有研究显示肝组织对 化17细胞具有分化优势，在肝脏自身免疫和其它肝脏炎症性疾病方面，肝脏微环境对化17 细胞的诱导非常重要，并且己肝病毒感染者和肝癌患者体内，化17细胞显著增多，该些现象 都引起了研究人员对化17细胞的广泛关注。
[0003]IL-23,属于IL-12家族，是由pl9和p40两个亚基构成的异二聚体，与IL-12共享 p40亚基，p40和pl9亚基能分别与比-23受体复合物的IL-12R0 1和IL-23R亚单位结合 并发挥作用。比-23是化17细胞分化发育和功能维持过程中的重要因子，通过刺激T细胞 分泌IL-17发挥促炎症作用，比-23的缺失会显著降低化17细胞生成，同时可降低模型鼠 自身免疫性疾病的发生率、减轻其发病的严重程度。很多证据证明IL-23/化17/比-17轴在 自身免疫性疾病发生发展过程中发挥着重要的作用，可W作为一个新的药物作用祀。
[0004] 蛋白质类药物是治疗自身免疫性疾病的新热点，该类药物针对性强、疗效好，但由 于半衰期短，在动物实验或临床研究中，不得不反复给药，应用受到限制。如何延长重组蛋 白血浆半衰期和增强稳定性是生物制药领域的热点，其中通过构建化融合蛋白来实现此 目的是可行性较高的策略。化融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物学活性的 功能蛋白分子（可溶性配体、受体或其他需要延长半衰期的生物活性物质）与Fc片段融合 而产生的新型重组蛋白。该类融合蛋白不仅保留了功能蛋白分子的生物学活性，还具有许 多特殊性质；化片段可与化化呈抑依赖性结合，能延长融合蛋白半衰期，提高稳定性，使 其更适合在人体内发挥作用；Fc片段的链间二硫键有利于融合分子形成多聚体，从而增强 配体结合能力和提高生物活性；化片段的引入有利于提高融合分子在哺乳动物细胞内的 表达水平。
[0005] 高向东等在CN102206667A重组质粒祀T32a-h比-23R-CHR及其构建表达中通 过大肠杆菌表达了一种能够特异性结合IL-2化19亚基的新分子一一IL23R-CHR，并进一 步研究 了其体外活性（GuoW，LuoC，WangC，etal.ProtectionagainstThl7cells differentiationbyaninterleukin-23receptorcytokine-bindinghomology region)。该蛋白为可溶性IL-23R胞外区细胞因子结合同源片段，能够特异性与IL-23结 合，阻断IL-23/化17轴信号通路。IL23R-CHR虽然有一定的抑制化17分化发育的体外活 性，但是由于是经原核表达，缺少真核转录后的蛋白修饰过程，故具有半衰期较短，稳定性 较差和内毒素难除去等缺点。为解决上述问题，本发明合成IL23R-CHR/FC(含有IL-23R信 号肤序列）融合基因，从密码子偏爱性和稳定mRNA二级结构等方面优化基因序列，构建高 效真核表达载体，转染哺乳动物细胞，高表达IL23R-CHR-化融合蛋白并筛选稳定表达细胞 株，力求获得在蛋白折叠、理化性质和生物学活性等方面更接近于天然状态的蛋白分子，同 时，还通过建立鼠和人化17细胞分化发育平台和相关自身免疫性疾病动物模型，研究该融 合分子的体内和体外活性。本专利所述rhIL23R-CHR/化蛋白分子，血浆半衰期约为40小 时；能够特异性阻断IL-23/IL-17信号通路，降低体内体外异常增高的化17细胞水平，改善 疾病症状，且活性高于rhIL23R/化蛋白分子和23R-CHR分子；并且该融合蛋白比-23R-CHR 部分为受体胞外区，主要与血液游离IL-23结合，故其属于非溶细胞性Fc融合蛋白，即该融 合分子通过化片段诱发ADCC和CDC效应的能力很低，不易导致细胞损伤，从而更适合治疗 W化17细胞功能异常和IL-23高表达为特征的慢性疾病，如自身免疫性疾病或慢性感染 等。
【发明内容】
[0006] 本发明选择IL-2化19亚基为祀分子，构建并表达了一种能与之结合并抑制 其作用的比-23受体细胞因子结合同源区/化融合蛋白，即比-23R-CHR/化融合蛋白 (IL-23receptorcytokine-bindinghomologyregion/Fcfusionprotein)，并对基因进 行优化，W期提高在真核细胞中的表达量和结合游离IL-23的能力，为自身免疫性疾病和 慢性感染疾病的治疗提供新的选择。
[0007] 本发明解决的第一个问题是通过密码子优化技术，设计并合成能够在CK)细胞中 高效表达的包含IL-23R信号肤的IL-23R-CHR/化融合基因，连接至原核或真核载体，如T vector、pcDNA3. 1等，并转化大肠杆菌，W扩增基因。
[0008] 本发明解决的第二个问题是通过脂质体包裹无内毒素抽提的重组真核表达载体 PCDNA3. 1(+)-比-23R-CHR/FC，瞬时转染293或293T细胞，实现质粒扩增和蛋白瞬时表达。
[0009] 本发明解决的第=个问题是利用廉价的PEI进行转染，降低短期大量收集真核表 达蛋白的瞬时转染成本。
[0010] 本发明解决的第四个问题是转染细胞培养3-5天后，离屯、沉降细胞，取细胞上清， 0. 45um滤器过滤除杂，利用proteinA柱纯化化融合蛋白，并经SDS-PAGE和WB鉴定。
[0011] 本发明解决的第五个问题是通过脂质体转染或电转技术将真核表达载体转染至 C册细胞，G418加压筛选，获得高效表达比-23R-CHR/化融合蛋白的CH0单克隆细胞株。
[0012] 本发明解决的第六个问题是悬浮培养稳定转染细胞株，大量收集分泌蛋白，分离 纯化，分析鉴定并冻干保存。
[0013] 本发明解决的第^;：个问题是对wistar大鼠尾静脉注射IL23R-CHRA^C融合蛋白， 在注射后的1、2、4、8、12、24、28、32、36、48、72、96、144小时分别进行眼眶取血，￡1^54方法 检测融合蛋白残存量，计算其半衰期。
[0014] 本发明解决的第八个问题是体外诱导化17细胞分化发育，在刺激T细胞向化17 细胞分化的同时，加入不同浓度的rhIL23R-CHR/化蛋白，通过流式技术检测化17细胞分化 情况，ELISA法检测培养上清相关细胞因子表达情况，从而研究融合蛋白对化17细胞分化 发育的影响。
[0015] 本发明解决的第九个问题是建立多发性硬化症动物模型EAE，设置正常组、模型 组、IL23R-CHR/化组和环抱菌素阳性药，研究并比较IL23R-CHR/化蛋白对相关疾病的治疗 作用。
[0016] 本发明解决的第十个问题是建立类风湿性关节炎动物模型CIA，设置正常组、模型 组、IL23R-CHR/化组和环抱菌素阳性药，研究并比较IL23R-CHR/化蛋白对相关疾病的治疗 作用。
[0017] 本发明解决的第十一个问题是建立DSS肠炎动物模型，设置正常组、模型组、 IL23R-CHR/化组、p40抗体阳性药组和IL23R-CHR组，研究并比较IL23R-CHR/化蛋白对相 关疾病的治疗作用。
[0018]本发明解决的第十二个问题是建立慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠模型，设 置正常组、模型组、IL23R-CHR/化组、IL23R-CHR干预组和p40抗体阳性药组，研究并比较 IL23R-CHR/化蛋白对相关疾病的治疗作用。
[0019] 本发明解决的第十S个问题是建立ConA诱导的急性肝损伤动物模型，设置正常 组、模型组、IL23R-CHR/化组和IL23R-CHR组，研究并比较IL23R-CHR/化蛋白对相关疾病 的治疗作用。
[0020] 本发明解决的第十四个问题是建立银屑病样炎症模型，设置正常组、模型组、 IL23R-CHR/化组、比-23R/化组、IL23R-CHR和p40抗体阳性药组，研究并比较IL23R-CHR/ Fc蛋白对相关疾病的治疗作用。
[0021] 本发明解决的第十五个问题是建立小鼠原位肝癌模型，设置正常对照组、肝癌模 型组、IL23R-CHR/化蛋白组、IL23R/化蛋白组和IL23R-CHR蛋白组，研究并比较IL23R-CHR/ Fc蛋白对相关疾病的治疗作用。
【附图说明】
[0022] 图 1IL23R-CHR/化构建PCR图
[0023] 1 ;IL23R-CHR/化基因；2 ;IL23R-CHR基因（含信号肤）；
[0024] 3;hIgG化基因
[00巧]