分用生化分析仪 测定胆固醇、甘油S醋、白蛋白、血肌酢、尿素氮等指标；另一部分用试剂盒检测抗dsDNA抗 体和抗核抗体水平。2周后，各诱导组均开始出现抗dsDNA抗体阳性，12周时有所增加，模 型组阳性率高于其他组，IL23R-CHR/化具有较好的抑制抗体生成活性；正常组无阳性（图 27)。
[0199] C)外周血化17细胞亚群的测定；12周时取小鼠肝素抗凝外周血，分别进行胞内胞 外的巧光染色标记，流式细胞仪检测不同组化17 (CD4+IL17+)的分化比例。模型组化17细 胞分化率最高，IL23R-CHR/化蛋白干预组化17细胞分化率显著低于模型组。
[0200] d)外周血化17细胞相关细胞因子表达测定；12周时取小鼠肝素抗凝外周血， ELISA试剂盒检测比-17，比-22等化17细胞相关细胞因子表达水平，并经实时定量PCR检 测转录水平。
[0201]IL23R-CHR/化蛋白干预组相比于模型组IL-17,IL-22表达水平降低。
[020引e)肾组织标本；12周断颈处死小鼠，取出双侧肾，10%甲醒固定4她后制备石蜡切 片，肥、PAS等染色，普通光学显微镜下观察。计算每个肾小球横截面细胞核总数；经PAS染 色半定量计分法测量肾小球硬化程度，每只小鼠计算25个肾小球，取平均值，肾小球硬化 程度可分为5个等级；0;基本正常或肾小球无病变；+;受损< 25% ;++;受损26%~50% ; +++;觉损面积51 %~75% ;++++;觉损面积75 %~100%。据每片肾小球平均硬化面积 积分计算出GSI(肾小球硬化指数），公式为；GSI= (lXnl+2Xn2+3Xn3)/每片肾小球总 数]X100% (n表示病变小球数）。模型组GSI得分明显高于正常组，各蛋白干预组得分介 于两者之间，且得分p40抗体组>IL23R-CHR组>IL23R-CHR/化组（图28)。
[0203] 实施例13 ;融合蛋白体内活性一一改善ConA诱导的急性肝损伤动物模型症状
[0204] 1)模型建立；
[020引 6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为四组，模型组、IL23R-CHR/化融合蛋白组、IL23R-CHR组和空白对照组。在造模前先分别尾静脉给予蛋白干预组模型鼠适量相关蛋 白。无菌生理盐水稀释ConA，W20mg/kg剂量尾静脉注射小鼠诱导模型，对照组注射等体积 PBS。
[0206] 2)病理指标检测；
[0207]a)血清转氨酶测定；ConA处理后12h，实验小鼠眼眶取血，离屯、取上清，W谷丙转 氨酶（ALT)试剂盒测定各组ALT水平。模型组小鼠血清转氨酶水平较正常对照组明显升高， 蛋白干预组有一定的抑制作用，且IL23R-CHR/化抑制ALT升高的作用强于IL23R-CHR(图 29)。
[020引b)血清细胞因子检测；ELISA试剂盒检测不同组血液上清TNF-a和IL-6两个重 要的肝炎炎性指标，W及化17相关细胞因子表达水平。模型组小鼠两个炎性指标的水平较 正常对照组明显升高，蛋白干预组有一定的抑制作用，且IL23R-CHR/化的炎症抑制作用强 于IL23R-CHR(图 30)。
[0209]C)肝脏组织病理学分析；取血完毕后，无菌取小鼠肝脏组织，一部分经10%甲醒 固定，石蜡包埋，切片后肥染色；一部分WIL-17为特异性抗体，继续做免疫组化实验，比较 肝脏受损严重程度。模型组肝组织有大量炎性细胞浸润和局部肝细胞坏死，IL23R-CHR/化 组肝组织少量炎性浸润，IL23R-CHR组炎性浸润且轻微肝细胞坏死，正常组无炎症。
[0210]d)实时定量RT-PCR检测相关细胞因子转录情况：按照操作说明使用Trizol提取 肝脏总RNA，逆转录合成cDNA，再通过Real-timePCR检测比-17等化17相关细胞因子的转 录情况。比-17表达水平IL23R-CHR/化显著降低，降低程度大于IL23R-CHR组。
[0211] 实施例14 ;融合蛋白体内活性一一改善银屑病样炎症模型症状
[0212] 1)模型建立
[021引将5周龄雌性BALB/c小鼠随机分为6组；对照组、模型组、IL23R-CHR/化蛋白干 预组、IL23R-CHR蛋白干预组、IL23R/化组和p40抗体阳性药组。小鼠背部剌毛，面积约为 3cmX5cm，除对照组给予外用基质乳膏，其余各组均给予咪嗟莫特乳膏，每日一次，连续6 天，单指轻压按摩约60次。
[0214]。模型评价
[0215] 每天观察局部皮肤变化，照相记录，计算银屑病样炎症的校正PASI评分。由于受 累面积相对固定，按照红斑、鱗屑和皮肤肥厚程度对PASI进行校正，每个指标对应得分如 下，S者相加为最后PASI总分。
[0引引表2PASI打分标准[0217]
【主权项】
1. 一种IL-23受体胞外区细胞因子结合同源区/Fe融合蛋白，即IL-23R-CHR/Fc融合 蛋白（IL_23receptorcytokine-bindinghomologyregion/Fcfusionprotein)，其特征 在于包含选自人的IL-23R-CHR基因片段和选自人或者其他动物的Fe片段，所说Fe片段为 天然型Fe或经氨基酸优化后的Fc，以及受体和/或补体结合相关的氨基酸改变的突变型 Fc0
2. 权利要求1所述的IL-23R-CHR/Fc融合蛋白，其IL-23R-CHR片段来自人IL-23受体， 具有如SEQID. 1所示基因序列和如SEQID. 2所示氨基酸序列，以及根据密码子兼并性，能 编码相同氨基酸序列，但核苷酸被替换的基因序列。其中前72个核苷酸编码信号肽序列。
3. 权利要求1所述的Fe片段选自人或动物的免疫球蛋白IgG，IgM，IgD，IgA或者它们 的亚型（如IgGl，IgG2,IgG3,IgG4,优选IgGl)，包含Fe全长或其部分序列。
4. 权利要求3所述的IgGlFe基因序列包含但不限于SEQID. 3和SEQID. 4;同时包 含但不限于与之对应的氨基酸序列SEQID5和SEQID6。
5. 权利要求1所述的融合蛋白，IL23R-CHR与Fe之间为直接融合或通过连接序列融 合。
6. 对权利要求1所述融合蛋白基因进行密码子优化，获得三种能够在CHO细胞里面高 效表达的基因序列，分别为SEDID7,SEDID8和SEDID9。
7. -种包含权利要求1-6中任意一种IL23R-CHR/FC融合蛋白编码DNA序列的载体，包 括真核载体和原核载体。
8. -种包含权利要求1-6中任意一种IL23R-CHR-FC融合蛋白DNA编码序列载体的宿 主细胞，包括真核细胞或原核细胞。
9. 含IL23R-CHR-Fc/pcDNA3. 1 (+)质粒的大肠埃希菌。 10. IL23R-CHR-Fc融合蛋白稳定表达CHO细胞株。
11. 权利要求1-6中任意一种IL23R-CHR-FC融合蛋白治疗以Thl7功能异常和IL-23 高表达为特征的自身免疫性疾病用途，包括但不限于类风湿性关节炎，克隆恩症，多发性硬 化症和系统性红斑狼疮等。
12. 权利要求1-6中任意一种IL23R-CHR-FC融合蛋白改善多发性硬化症动物模型EAE 疾病症状。
13. 权利要求1-6中任意一种IL23R-CHR-FC融合蛋白改善类风湿性关节炎动物模型 CIA疾病症状。
14. 权利要求1-6中任意一种IL23R-CHR-FC融合蛋白改善肠炎动物模型疾病症状。
15. 权利要求1-6中任意一种IL23R-CHR-FC融合蛋白改善系统性红斑狼疮动物模型疾 病症状。
16. 权利要求1-6中任意一种IL23R-CHR-FC融合蛋白改善肝炎动物模型疾病症状。
17. 权利要求1-6中任意一种IL23R-CHR-FC融合蛋白改善银肩病样炎症模型疾病症 状。
18. 权利要求1-6中任意一种IL23R-CHR-FC融合蛋白改善小鼠原位肝癌模型疾病症 状。
19. 权利要求1-6中任意一种IL23R-CHR-FC融合蛋白改善其他以Thl7功能异常和 IL-23高表达为特征的自身免疫性疾病动物模型疾病症状的应用。
20.包含权利要求1-6中任意一种IL23R-CHR-Fc融合蛋白的药物组合物及其应用。
【专利摘要】本发明涉及一种能结合并拮抗IL-23作用的重组人IL-23受体胞外区/Fc融合蛋白。融合蛋白编码基因富含哺乳动物细胞偏爱密码子，并经CHO稳定转染细胞株高表达。该蛋白由基因优化的IL-23R-CHR活性片段和人免疫球蛋白分子Fc片段融合而成，不仅克服了原核表达IL-23R-CHR片段半衰期短、稳定性较差和内毒素难除去的缺点，保留了IL-23-CHR的生物学活性，而且由于不具有ADCC和CDC效应，从而更适合治疗慢性疾病，如自身免疫性疾病和慢性感染。本发明包括该类融合蛋白的分子设计、表达纯化、稳定表达细胞株的构建和疾病治疗等方面的内容。
【IPC分类】A61P37-02, C12R1-185, C07K19-00, C12N1-21, C12N5-10, C12N15-63, A61K38-16
【公开号】CN104725514
【申请号】CN201510071915
【发明人】高向东, 郭薇, 王欣, 姚文兵, 王辰, 郁冬梅, 陈语聪, 王宇恒
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年2月6日