特异性鉴别羊乳中掺加牛乳的单克隆抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种特异性鉴别羊乳中渗加牛乳的单克隆抗 体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 羊乳脂肪球和蛋白颗粒较小，仅为牛奶的1/3,尤其是羊乳成分和人类母乳相对接 近，人体吸收率达95%。在欧美及国内港澳台市场，羊奶价格远远高于牛乳，国内越来越多的 消费者也趋向于选择羊乳。但羊乳产量有限，市场上供不应求，有人在羊乳中渗加牛乳，严 重影响羊乳产品的声誉，损害消费者的利益。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种特异性鉴别羊乳中渗加牛乳的单克隆抗体及其制备方 法，所得单克隆抗体仅识别牛乳非乳清抗原，而不与羊乳发生交叉反应。
[0004] 本发明所采用的技术方案是； 特异性鉴别羊乳中渗加牛乳的单克隆抗体的制备方法，其特征在于： 包括W下步骤： 步骤一；制备免疫抗原： 取新鲜牛乳置于4°C离屯、机，4000~600化pm，10~20min离屯、；牛乳分层，上层主要为脂 肪，完全弃去，保留并充分混匀剩余部分，即为脱脂乳，作为免疫抗原； 步骤二；免疫： 取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，利用免疫抗原免疫4次，免疫结束S天后进行细胞融合； 步骤制备杂交瘤细胞： 细胞融合前一天，制备饲养层细胞； 细胞融合于无菌条件下进行，将分离的脾细胞与SP2/0瘤细胞按（5-10) ;1的比例混 合，在PEG1500的作用下进行细胞融合，将融合后的杂交瘤细胞铺于含有饲养层细胞的96 孔细胞培养板中，置于37°C，5% C〇2培养箱中培养； 步骤四：筛选杂交瘤细胞： 按照常规间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清；分别用鲜牛乳、鲜羊乳、牛乳清作为包 被抗原，200ul/孔，包被后，4°C过夜，PBST洗漆3遍，加入细胞培养上清，W阴性小鼠血清 作为阴性对照，lOOul/孔，每个稀释度做3个重复，37°C解育1~2h，PBST洗漆3遍，加入辣 根过氧化物酶标记的抗体，1:5000稀释，lOOul/孔，37°C解育比，PBST洗漆3遍，加入TMB 显色液，37°C解育20min，加入终止液，置于酶标仪检测各孔0〇45。值，W S/P〉2. 1为阳性判断 标准，标记并筛选含有阳性杂交瘤细胞的细胞培养孔； 将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行单克隆化培养，单克隆化培养采用有限稀释法；首 先，进行细胞计数，根据细胞计数结果，对细胞悬液进行稀释；取230个活细胞悬浮于4. 6ml 的RPMI1640培养基中，此时，平均每0. 1ml溶液含有5个细胞，接种于96孔板，每孔0. 1ml， 共36孔；剩余1ml，再加4mlRPMI 1640培养基，共5ml，此时，平均每0. 1ml溶液含1个细胞， 接种于其次的36孔，每孔0. 1ml ;最后剩余1. 4ml，再补加1. 4ml，共2. 4ml，接种于剩余24 孔，每孔0. 1ml，此时每孔0. 5个细胞；铺板结束后，置于显微镜下，标记出只含有一个细胞 的细胞培养孔； 得到的杂交瘤细胞稳定分泌单克隆抗体，能够特异性识别牛乳中的非乳清抗原，且与 羊乳不存在交叉反应。
[0005] 步骤二中，所述免疫方案如下： 首次免疫，将脱脂乳与完全弗氏佐剂等体积混匀，形成油包水状态，W 100~200ul/只 的剂量免疫小鼠，腹部皮下多点注射； 二免于首免后2周进行，将脱脂乳与不完全弗氏佐剂等量混合，形成油包水状态，W 100~200ul/只的剂量免疫小鼠，腹部皮下多点注射； S免于二免后2周进行，直接注射脱脂乳，50~lOOul/只，腹腔注射； S免后一周，进行加强免疫，直接注射脱脂乳，50~lOOul/只，腹腔注射。
[0006] 步骤=中，所述饲养层细胞的制备方案为： 无菌条件下，抽取BALB/c小鼠腹腔巨瞻细胞，铺于96孔细胞培养板备用。
[0007] 通过步骤四得到单克隆化杂交瘤细胞后，通过制备小鼠腹水扩大培养，包含W下 步骤： 小鼠注射液体石蜡，一周后，每只小鼠注射105个杂交瘤细胞细胞，10~20天，小鼠大 量产生腹水，将抽取的腹水，100化pm离屯、5~lOmin，去除上层油脂及下层沉淀，收集澄清的 腹水，置于-80 °C保存。
[000引如所述的特异性鉴别羊乳中渗加牛乳的单克隆抗体的制备方法制备的单克隆抗 体。
[0009] 本发明具有W下优点： 本发明W脱脂牛乳为抗原，免疫BALB/c小鼠，分离脾细胞进行细胞融合，筛选出具有 稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，所获单克隆抗体能够特异性识别牛乳中的非乳清抗 原，其识别牛乳的最低限度为0. 2%，且与羊乳不发生交叉反应，可用于开发检测试纸条，检 测试剂盒等，为开发羊乳中渗加牛乳检测试剂盒等检测产品奠定基础。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0011] 本发明设及的特异性鉴别羊乳中渗加牛乳的单克隆抗体的制备方法，包括W下步 骤： 步骤一；制备免疫抗原： 取新鲜牛乳(来自荷斯坦牛）置于4°c离屯、机，4000~60(K)巧m，10~20min离屯、；牛乳分 层，上层主要为脂肪，完全弃去，保留并充分混匀剩余部分，即为脱脂乳，作为免疫抗原。
[0012] 步骤二；免疫； 取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，利用免疫抗原免疫4次，免疫结束S天后进行细胞融合。
[0013] 所述免疫方案如下： 首次免疫，将脱脂乳与完全弗氏佐剂等体积混匀，形成油包水状态，W 100~200ul/只 的剂量免疫小鼠，腹部皮下多点注射； 二免于首免后2周进行，将脱脂乳与不完全弗氏佐剂等量混合，形成油包水状态，W 100~200ul/只的剂量免疫小鼠，腹部皮下多点注射； S免于二免后2周进行，直接注射脱脂乳，50~lOOul/只，腹腔注射； S免后一周，进行加强免疫，直接注射脱脂乳，50~lOOul/只，腹腔注射。
[0014] 步骤S ;制备杂交瘤细胞： 细胞融合前一天，制备饲养层细胞。
[0015] 所述饲养层细胞的制备方案为： 无菌条件下，抽取BALB/c小鼠腹腔巨瞻细胞，铺于96孔细胞培养板备用。
[0016] 细胞融合于无菌条件下进行，将分离的脾细胞与SP2/0瘤细胞按（5-10);1的比例 混合，在PEG1500的作用下进行细胞融合，将融合后的杂交瘤细胞铺于含有饲养层细胞的 96孔细胞培养板中，置于37°C，5% C〇2培养箱中培养； 步骤四：筛选杂交瘤细胞： 按照常规间接化ISA检测杂交瘤细胞培养上清；分别用鲜牛乳、鲜羊乳、牛乳清作为包 被抗原，200ul/孔，包被后，4°C过夜，PBST洗漆3遍，加入细胞培养上清，W阴性小鼠血清 作为阴性对照，lOOul/孔，每个稀释度做3个重复，37°C解育1~2h，PBST洗漆3遍，加入辣 根过氧化物酶标记的抗体，1:5000稀释，lOOul/孔，37°C解育比，PBST洗漆3遍，加入TMB 显色液，37°C解育20min，加入终止液，置于酶标仪检测各孔0〇45。值，WS/P〉2. 1为阳性判断 标准，标记并筛选含有阳性杂交瘤细胞的细胞培养孔； 将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行单克隆化培养，单克隆化培养采用有限稀释法；首 先，进行细胞计数，根据细胞计数结果，对细胞悬液进行稀释；取230个活细胞悬浮于4. 6ml 的RPMI1640培养基中，此时，平均每0. 1ml溶液含有5个细胞，接种于96孔板，每孔0.