1ml， 共36孔；剩余1ml，再加4mlRPMI 1640培养基，共5ml，此时，平均每0. 1ml溶液含1个细胞， 接种于其次的36孔，每孔0. 1ml ;最后剩余1. 4ml，再补加1. 4ml，共2. 4ml，接种于剩余24 孔，每孔0. 1ml，此时每孔0. 5个细胞；铺板结束后，置于显微镜下，标记出只含有一个细胞 的细胞培养孔； 得到的杂交瘤细胞稳定分泌单克隆抗体，能够特异性识别牛乳中的非乳清抗原，且与 羊乳不存在交叉反应。
[0017] 通过步骤四得到单克隆化杂交瘤细胞后，通过制备小鼠腹水扩大培养，包含W下 步骤： 小鼠注射液体石蜡，一周后，每只小鼠注射105个杂交瘤细胞细胞，10~20天，小鼠大 量产生腹水，将抽取的腹水，100化pm离屯、5~lOmin，去除上层油脂及下层沉淀，收集澄清的 腹水，置于-80°C保存。
[0018] 1、单克隆抗体鉴定： 1)单克隆抗体亚型鉴定： 亚型鉴定采用Sigma公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定，具体步骤按试 剂盒的说明书操作。主要步骤如下： 将待测细胞培养上清加入已包被抗原的酶标板中，lOOul/孔，室温下作用2h，PBST洗 漆3次。同型特异试剂IgM、IgA、IgGl、IgG2a、IgG化和IgG3,分别用PBST缓冲液1000倍 稀释，lOOul/孔，室温作用30min，PBST洗漆3遍。辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG，用 PBST W 1:2500稀释，lOOul/孔，室温作用15min，PBST洗漆3遍。加入新配底物，lOOul/ 孔，室温下作用l〇-15min。用3mol/L的化OH终止反应，50ul/孔，观察结果。本发明单克 隆抗体亚型为IgGl。
[0019] 2)单克隆抗体效价测定； 取新鲜牛乳，200ul/孔，包被后，4°C过夜，PBST洗漆3遍，加入10倍连续稀释的腹水， W阴性小鼠血清作为阴性对照，W PBST作为空白对照，lOOul/孔，每个稀释度做3个重复， 37°C解育1~化，PBST洗漆3遍，加入辣根过氧化物酶标记的抗体，1:5000稀释，lOOul/孔， 37°C解育lh，PBST洗漆3遍，加入TMB显色液，37°C解育20min，加入终止液，置于酶标仪检 测各孔〇〇45。值，W S/P〉2. 1为阳性判断标准，W阳性反应的最大稀释度作为腹水的检测效 价。
[0020] 细胞培养上清效价检测，将细胞培养上清倍比稀释，其余方法同上。
[0021] ELISA检测结果为细胞培养上清效价2W，小鼠腹水效价108。
[0022] 细胞培养上清检测结果：
【主权项】
1. 特异性鉴别羊乳中掺加牛乳的单克隆抗体的制备方法，其特征在于： 包括以下步骤： 步骤一：制备免疫抗原： 取新鲜牛乳置于4°C离心机，4000~6000rpm，10~20min离心；牛乳分层，上层主要为脂 肪，完全弃去，保留并充分混匀剩余部分，即为脱脂乳，作为免疫抗原； 步骤二：免疫： 取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，利用免疫抗原免疫4次，免疫结束三天后进行细胞融合； 步骤三：制备杂交瘤细胞： 细胞融合前一天，制备饲养层细胞； 细胞融合于无菌条件下进行，将分离的脾细胞与SP2/0瘤细胞按（5-10) :1的比例混 合，在PEG1500的作用下进行细胞融合，将融合后的杂交瘤细胞铺于含有饲养层细胞的96 孔细胞培养板中，置于37°C，5% 0)2培养箱中培养； 步骤四：筛选杂交瘤细胞： 按照常规间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清：分别用鲜牛乳、鲜羊乳、牛乳清作为包 被抗原，200ul/孔，包被后，4°C过夜，PBST洗涤3遍，加入细胞培养上清，以阴性小鼠血清 作为阴性对照，IOOul/孔，每个稀释度做3个重复，37°C孵育l~2h，PBST洗涤3遍，加入辣 根过氧化物酶标记的抗体，1:5000稀释，IOOul/孔，37°C孵育lh，PBST洗涤3遍，加入TMB 显色液，37°C孵育20min，加入终止液，置于酶标仪检测各孔OD45t^，以S/P>2. 1为阳性判断 标准，标记并筛选含有阳性杂交瘤细胞的细胞培养孔； 将筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行单克隆化培养，单克隆化培养采用有限稀释法：首 先，进行细胞计数，根据细胞计数结果，对细胞悬液进行稀释；取230个活细胞悬浮于4. 6ml 的RPMI1640培养基中，此时，平均每0.Iml溶液含有5个细胞，接种于96孔板，每孔0.Iml， 共36孔；剩余lml，再加4mlRPMI1640培养基，共5ml，此时，平均每0.Iml溶液含1个细胞， 接种于其次的36孔，每孔0.Iml;最后剩余I. 4ml，再补加I. 4ml，共2. 4ml，接种于剩余24 孔，每孔0.lml，此时每孔0.5个细胞；铺板结束后，置于显微镜下，标记出只含有一个细胞 的细胞培养孔； 得到的杂交瘤细胞稳定分泌单克隆抗体，能够特异性识别牛乳中的非乳清抗原，且与 羊乳不存在交叉反应。
2. 根据权利要求1所述的特异性鉴别羊乳中掺加牛乳的单克隆抗体的制备方法，其特 征在于： 步骤二中，所述免疫方案如下： 首次免疫，将脱脂乳与完全弗氏佐剂等体积混匀，形成油包水状态，以l〇〇~200ul/只 的剂量免疫小鼠，腹部皮下多点注射； 二免于首免后2周进行，将脱脂乳与不完全弗氏佐剂等量混合，形成油包水状态，以 100~200ul/只的剂量免疫小鼠，腹部皮下多点注射； 三免于二免后2周进行，直接注射脱脂乳，50~100ul/只，腹腔注射； 三免后一周，进行加强免疫，直接注射脱脂乳，50~100ul/只，腹腔注射。
3. 根据权利要求2所述的特异性鉴别羊乳中掺加牛乳的单克隆抗体的制备方法，其特 征在于： 步骤三中，所述饲养层细胞的制备方案为： 无菌条件下，抽取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞，铺于96孔细胞培养板备用。
4. 根据权利要求3所述的特异性鉴别羊乳中掺加牛乳的单克隆抗体的制备方法，其特 征在于： 通过步骤四得到单克隆化杂交瘤细胞后，通过制备小鼠腹水扩大培养，包含以下步 骤： 小鼠注射液体石蜡，一周后，每只小鼠注射105个杂交瘤细胞细胞，10~20天，小鼠大 量产生腹水，将抽取的腹水，1000 rpm离心5~10min，去除上层油脂及下层沉淀，收集澄清的 腹水，置于_80°C保存。
5. 如权利要求4所述的特异性鉴别羊乳中掺加牛乳的单克隆抗体的制备方法制备的 单克隆抗体。
【专利摘要】本发明涉及特异性鉴别羊乳中掺加牛乳的单克隆抗体及其制备方法。市场上常出现羊乳中掺加牛乳的现象，以次充好，影响羊乳质量。本发明以脱脂牛乳为抗原，免疫BALB/c小鼠，分离脾细胞与SP2/0瘤细胞进行细胞融合，筛选出具有稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，所获单克隆抗体能够特异性识别牛乳中的非乳清抗原，且与羊乳不存在交叉反应。本发明识别牛乳的最低限度为0.2%，可用于开发检测试纸条，检测试剂盒等，为开发羊乳中掺加牛乳检测试剂盒等检测产品奠定基础。
【IPC分类】C07K16-18
【公开号】CN104725508
【申请号】CN201510174843
【发明人】陈德坤, 刘鹤媛, 张洪杰, 桑锋锋, 周铭, 岳进华, 霍宁宁, 杨雯昱, 高洋, 赵燕青
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年4月14日