血清在鸭胚上进行中和试验和交叉中和试验，确诊为DHAV-3的肝脏 组织病料用于鸡胚培养分离病毒。
[0015] 2.组织病料的处理：取少许DHAV-3的鸭肝脏组织病料，用灭菌生理盐水做1 : 5 (W/V)左右稀释、研磨、冻融2~3次、3000r/min离心10min，取离心上清液经0. 22um滤器 去菌过滤。
[0016] 3.鸡胚接种分离病毒：取上述无菌滤液通过卵黄囊接种途径接种6~8日龄SPF 鸡胚，接种操作方法见图1，每只胚接种0. 2~0. 5ml，每次接种5~10枚鸡胚，37°C温箱培 养，定时观察鸡胚死亡情况，24h内死胚弃之，连续观察至120h。其间若有鸡胚死亡，随时取 出置2~8°C冰箱冷藏数小时或过夜；若无死亡，则于72~96h随机取3枚胚置2~8°C冷 藏过夜。
[0017] 4.鸡胚传代接种：及时取出上述冷藏鸡胚无菌操作取出胚体，并观察胚体病变情 况，将鸡胚研磨成勾衆、3000r/min离心10min，取离心上清液经0. 22 μ m滤器去菌过滤。将 无菌滤液再通过卵黄囊接种途径接种6~8日龄SPF鸡胚，每只胚接种0. 2~0. 5ml，每次 接种5~10枚鸡胚培养，最初几次传代在120h内鸡胚不出现死亡或个别死亡，但通过鸡胚 卵黄囊接种盲传5~10代后，则可见鸡胚在接种后120h内开始出现死亡，随着传代次数的 增加，鸡胚死亡时间前移，逐渐集中在接种后48~96h内，鸡胚死亡率也逐渐达到100%，表 明通过鸡胚分离病毒成功，并逐渐适应鸡胚培养。
[0018] 本发明涉及的微生物资源信息
[0019] 本发明涉及的微生物有：血清3型鸭甲型肝炎病毒（duck h印atitis A virus, DHAV-3) HuB株，由湖北分离到（此毒株继续通过鸡胚传代病毒株毒力减弱获得了制 备疫苗的弱毒病毒株，命名为血清3型鸭甲型肝炎病毒（duck h印atitis A virus，DHAV-3) HuB60株，该毒株已于2015年01月06日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研宄所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.10307);血清3型鸭甲型肝炎病毒（duck h印atitis A virus，DHAV-3)SDLY毒株由山东 分到；血清3型鸭甲型肝炎病毒（duck h印atitis A virus，DHAV-3)JSXZ毒株由江苏分离 到；血清3型鸭甲型肝炎病毒（duck hepatitis A virus, DHAV-3)HeBHD毒株由河北分离 到。
【附图说明】
[0020] 图1鸡胚卵黄囊接种示意图
[0021] 本发明的积极意义
[0022] 本发明涉及一种鸡胚分离培养DHAV-3的方法。DHAV-3引起的鸭肝炎，虽然可以通 过鸭胚分离和培养病毒，但是通过常规的鸡胚尿囊腔接种的方法很难培养和分离该病毒， 本发明采用接种无特定病原（SPF)鸡胚卵黄囊由患病鸭病料中分离出DHV-3,并能通过SPF 鸡胚卵黄囊进行培养和传代，为血清3型鸭肝炎病毒分离培养、弱毒活疫苗的研制奠定基 础。 实施例
[0023] 实施例1
[0024] --DHAV-3HuB毒株分离
[0025] 对湖北某鸭场临床发生典型鸭肝炎症状5日龄病死鸭，无菌操作取肝脏组织经实 验室鉴定：（I)RT-PCR检测：取肝组织样品提取RNA，经PCR扩增和电泳，出现DHAV-3特异性 条带；(2)病毒分离：取少许肝脏组织，用每毫升含青、链霉素各1000单位的灭菌生理盐水 做I : 10(W/V)稀释、研磨、冻融2次、3000r/min离心10min，取离心上清液经0· 22 μπι滤 器去菌过滤，取该滤液通过尿囊腔途径接种11日龄敏感鸭胚5只，每只胚接种0. 2ml，37°C 温箱培养，于接种后48~96h鸭胚全部死亡。（3)血清中和试验鉴定：取死亡鸭胚尿囊液 100倍稀释，分别与等量抗DHAV-I阳性血清和抗DHAV-3阳性血清作用Ih后，在鸭胚上进行 血清中和试验和交叉中和试验，见表1。实验室检测结果表明，湖北某鸭场临床发生的鸭肝 炎为DHAV-3所致。
[0026] 表1血清中和试验和交叉中和试验结果
[0027]
【主权项】
1. 一种鸡胚分离培养血清3型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-3)的方法，其特征在于该方法包 括以下步骤： (1) 选取经抗血清1型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-I)阳性血清和抗DHAV-3阳性血清在 鸭胚上进行中和试验和交叉中和试验确诊为DHAV-3的肝脏组织病料用于鸡胚培养分离病 毒； (2)DHAV-3的组织病料的处理：取少许DHAV-3的肝脏组织，用灭菌生理盐水做1:5(W/ V)左右稀释、研磨、冻融2~3次、离心，取离心上清液经0. 22ym滤器除菌过滤； (3) 鸡胚接种分离病毒：取上述无菌滤液通过卵黄囊接种途径接种6~8日龄SPF鸡 胚，每只胚接种0. 2~0. 5ml，37°C培养，24h内死胚弃之，连续观察至120h，其间若有鸡胚死 亡，随时取出置2~8°C冰箱冷藏数小时或过夜；若无死亡，则于72~96h随机取3枚胚置 2~8°C冷藏过夜； (4) 鸡胚传代接种：及时取出胚体，研磨成匀浆、离心取上清液经0.22ym除菌过滤，取 滤液经卵黄囊接种6~8日龄SPF鸡胚5~10枚，每只胚0. 2~0. 5ml;盲传5~10代， 随着传代次数的增加，鸡胚死亡时间前移，鸡胚死亡率也逐渐达到1〇〇 %，表明通过鸡胚分 离病毒成功，并逐渐适应鸡胚培养。
【专利摘要】本发明涉及一种鸡胚分离培养血清3型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-3)的方法。DHAV-3可致雏鸭发生肝炎，虽然可以通过鸭胚分离和培养病毒，但是通过常规的鸡胚尿囊腔接种的方法很难培养和分离该病毒，本发明采用接种无特定病原(SPF)鸡胚卵黄囊的方法由患病鸭病料中分离出DHAV-3，并能通过SPF鸡胚卵黄囊进行培养和传代，为DHAV-3分离培养、弱毒活疫苗的研制奠定基础。CGMCC No.1030720150106
【IPC分类】C12N7-00, C12R1-93
【公开号】CN104726415
【申请号】CN201510007213
【发明人】张小飞, 卢凤英, 黄显明
【申请人】南京天邦生物科技有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年1月7日