一种冷水可凝的培养基凝固剂及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于微生物培养和检测的冷水可凝的培养基凝固剂及其制备方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 平板倾注法是微生物检测的经典方法，具有良好的准确度和灵敏度，其中培养基 凝固剂在细菌培养、分离、鉴定中担当着重要作用。目前琼脂是应用最广泛的培养基凝固 剂，但其存在以下问题：（1)过分开采导致价格昂贵；（2)凝胶水分容易挥发；（3)凝结水 积聚在培养皿壁容易造成菌落间污染；（4)冰冻易产生结晶或裂开，不利于菌种传代和长 期保藏。另外，因为琼脂不能在冷水中凝固，在制备微生物培养基时，需要先加热、冷却后才 能倒平板使用，大大影响了检测效率。故平板倾注法具有操作繁琐、费时费工、对技术人员 和设备条件要求1?等缺点。
[0003] 发展快速、准确、方便的微生物检验方法越来越受到人们的重视，目前大概可以分 为两大类：一类是利用现代分子生物学技术和自动化分析仪器结合建立起来的微生物快 速检验方法，如利用阻抗法建立起来的细菌计数系统，利用ATP荧光酶的生物发光快速检 测仪，利用生化鉴定方法的全自动细菌自动鉴别系统，以及自动酶联荧光免疫（VIDAS分析 法）、金标免疫分析方法（GLISA)，DNA探针和荧光定量PCR分析仪等，这一类技术和方法所 需仪器设备都比较昂贵，需要专门的实验室和专业技术操作人员，因此，难以普及推广；另 一类是在平板倾注法基础上发展起来的微生物测试片法，该法对平板倾注法进行了简化和 改进。微生物测试片法以纸片、无纺布或冷水可凝胶等代替琼脂作为载体，通过微生物的生 长显色来检测样品中的微生物。测试片干态保存，体积小重量轻，方便运输携带；检样前不 需要进行培养基的制备，直接接种样品，适宜温度培养计数即可，避免了配制差错及灭菌等 繁重的准备工作；也不需要冷却培养基的等待时间。因而测试片法具有更方便、更快捷的突 出优点。例如美国3M公司和广东绿洲生化科技有限公司生产的菌落测试片，均已获得广泛 的应用。但是3M公司的菌落测试片需要经过特殊的真空干燥条件，生产工艺复杂，需要成 本较高；需要在37°C恒温培养箱中培养48h，观察菌落数目，培养时间太长；凝固剂吸水比 较缓慢，加样过程中如果操作不慎会使检样液从边缘流出，从而影响结果。
[0004] 测试片的培养基载体对检测效果有重要影响，滤纸、无纺布和冷水可凝胶是三种 主流载体。国内的测试卡产品主要用滤纸作载体，如授权公告号为CN2908517Y的专利公开 了一种食品中病原微生物的测试片，该测试片以滤纸为载体。以滤纸作为载体主要存在以 下不足：滤孔过大导致滤纸双面都有菌落生长、菌落不清晰而难以准确计数；滤纸保水性 差，检验培养中又不能保持湿度，不利于菌体生长，导致菌落生长缓慢；滤纸测试卡还存在 营养物质分布不均匀的问题，检样液由于不能迅速扩散，从而导致菌落生长和分布不均匀； 测试片表面营养物质不够丰富、凝胶的粘度和保水性能差；菌落测试片中细菌不能用于菌 种的保藏和细菌的增殖。
[0005] 冷水可凝的培养基凝固剂（即冷水可凝胶）因其透明、结构稳定、回收率高和容易 挑菌等优点，使以其为载体的测试片的综合性能优于以滤纸、无纺布为载体的测试片。应 用冷水可凝的培养基凝固剂作为培养基的载体，在微生物快速测试片或测试平板工具中使 用，不需要预加热处理，能缩短检测的时间，直接滴加样品液几分钟就能凝固，之后能像使 用琼脂一样进行培养、计数和转接菌落等操作；而且携带方便，适合户外操作。公开号为 CN101570730A的专利公开了一种冷水可凝的培养基凝固剂及其制备方法。该培养基凝固剂 主要原料为黄原胶、瓜尔胶、聚丙烯酸钠和刺槐豆角，但其凝固剂强度、吸水性能和保水性 能等有待进一步提1?。
【发明内容】
[0006] 为了解决平板倾注法中琼脂使用前需要加热熔化和冷水不溶导致的操作繁琐、检 测效率低等问题，以及现有冷水可凝的培养基凝固剂的凝固剂强度、吸水性能和保水性能 有待提高的问题，本发明的主要目的在于提供一种使用前不需要加热熔化、冷水可溶、凝胶 强度高、吸水性能和保水性能优良的冷水可凝的培养基凝固剂。
[0007] 该冷水可凝的培养基凝固剂由以下重量份的原料组成：黄原胶、卡拉胶和瓜尔胶， 其中，
[0008] 所述黄原胶和卡拉胶的质量比为1-2:1 ;
[0009] 所述黄原胶和卡拉胶的混合物与瓜尔胶的质量比为1:0. 5-2. 5。
[0010] 优选地，所述黄原胶和卡拉胶的质量比为1:1 ;所述黄原胶和卡拉胶的混合物与 瓜尔胶的质量比为1:1.5。
[0011] 本发明的另一目的是提供上述冷水可凝的培养基凝固剂的制备方法，包括以下步 骤：
[0012] (1)分别粉碎黄原胶、卡拉胶和瓜尔胶，过筛；
[0013] (2)将粉碎过筛的黄原胶和卡拉胶以1-2:1的质量比混合均匀；
[0014] (3)将步骤（2)得到的混合物与瓜尔胶以1:0. 5-2. 5的质量比混合均匀。
[0015] 本发明以黄原胶、卡拉胶和瓜尔胶为原料，筛网过滤得到颗粒均一的混合物，即为 本发明所述的冷水可凝的培养基凝固剂，直接使用一定量的该培养基凝固剂加水即可形成 凝胶。该冷水可凝的培养基凝固剂无毒、透明、稳定、不易被分解、PH值为7±0. 2,中性；凝 固剂强度高，为300-550g/cm2 ;保水性能和吸水性能良好，吸水量为130-150g/g，适用于微 生物分离培养。
[0016] 为了解决现有微生物快速测试片（菌落总数测试片）生产工艺复杂、成本较高、培 养时间长、凝固剂吸水缓慢易影响检测结果的灵敏度和准确性等问题，本发明的又一目的 在于提供一种制作工艺比较简单、成本低、检测时间短、灵敏度高、检测范围广的菌落测试 片。该菌落测试片包括从下至上的底板、凝胶层和上层盖，其中所述凝胶层由本发明所述冷 水可凝的培养基凝固剂、营养肉汤培养基、显色剂和生长因子按照一定比例均匀混合而成。
[0017] 优选地，所述凝胶层中冷水可凝的培养基凝固剂和营养肉汤培养基的质量比为 16-20:8,更优选为 17:8。
[0018] 优选地，所述凝胶层中由冷水可凝的培养基凝固剂和营养肉汤培养基组成的混合 物与显色剂的质量比为750:1。
[0019] 优选地，所述显色剂为氯化三苯四氮唑（TTC )。
[0020] 优选地，所述生长因子包括由NAD+ (辅酶I )和酸水解酪蛋白组成的生长因子1以 及由脱氧胆酸钠（DOC)和甲基葡萄糖醛酸钠组成的生长因子2。
[0021] 更优选地，所述生长因子1中NAD+ (辅酶I )和酸水解酪蛋白的质量比为1:5 ;所 述生长因子2中脱氧胆酸钠（DOC)和甲基葡萄糖醛酸钠的质量比为9:1。
[0022] 优选地，上述由冷水可凝的培养基凝固剂、营养肉汤培养基与显色剂组成的混合 物与生长因子1、生长因子2的质量比为50:1:0. 5。
[0023] 优选地，所述底板选用聚酯、聚乙烯或聚丙烯类材料；所述上层盖选用聚乙烯材 料。
[0024] 本发明的再一目的在于提供一种菌落测试片的制备方法，具体包括如下步骤：
[0025] (1)将适当尺寸的涂覆一层压力敏感胶的底板和上层盖的底部利用双面胶进行粘 接，底板顶部贴上双面胶；
[0026] (2)将营养肉汤培养基、冷水可凝的培养基凝固剂、显色剂和生长因子按照一定的 比例均匀混合；
[0027] (3)将步骤（2)配制好的混合物均匀涂布到底板和上层盖之间；
[0028] (4)揭开底板顶部的双面胶，将底板和上层盖顶部粘合，装袋密封，气体消毒灭菌。
[0029] 优选地，所述底板为IOcmX 7cm，上层盖为10. 5cmX 7cm。
[0030] 优选地，所述贴在底板顶部的双面胶宽度为0. 5cm，粘贴在底板顶部的标签处。
[0031] 本发明的菌落测试片省去平板倾注法中配制培养基、清洗平皿、高压灭菌倒板等 繁琐的步骤，简化了微生物检测的操作方法，培养时间由平板倾注法的48h降低到现在的 18h，缩短检测时间，大大提高了检测效率，达到了节省时间，操作方便的快速检测效果；该 菌落测试片采用新型的冷水可凝的培养基凝固剂取代琼脂，克服了琼脂放置时间短、保水 性能差、吸水缓慢的问题，提高了检测的灵敏度和准确性；此外，该菌落测试片制作不需要 经过真空冷冻干燥，简化了制作工艺，缩短了制作时间，提高工作效率，降低制作成本；同时 该菌落测试片使用完毕后，可以直接焚烧处理，降低环境污染。
【附图说明】
[0032] 图1菌落测试片结构示意图。
[0033] 图2不同培养基凝固剂的保水率曲线图。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例，对本发明进一步描述。本发明实施例中所需要的环境条件 为温度27-30°C、湿度30-40%。
[0035] 黄原胶和瓜尔胶：淄博中轩生化有限公司。
[0036] 卡拉胶：西安大丰收生物科技有限公司。
[0037] 实施例1 :冷水可凝的培养基凝固剂的制备
[0038] 制备例1 :将粉碎后的黄原胶、卡拉胶和瓜尔胶分别过160目筛，取黄原胶、卡拉胶 和瓜尔胶各5g、5g、15g (质量比为1 :1 :3)混合均匀，即得到冷水可凝的培养基凝固剂。
[0039] 制备例2 :将粉碎后的黄原胶、卡拉胶和瓜尔胶分别过160目筛，取黄原胶、卡拉胶 和瓜尔胶各6g、6g、12g (质量比为1