一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法。
【背景技术】
[0002]转基因技术在生命科学的前沿领域中处于重要的地位，美国兰德公司在“2020年全球技术革命”研宄报告中，列举了 16个重大革命性技术，转基因技术排名第4位。2008年，我国启动的转基因生物新品种培育科技重大转项为《国家中长期科学和技术发展规划纲要(2006-2020年)》16个国家科技重大专项之一。转基因技术的研宄之所以受到如此的重视，主要是因为它在诸多领域具有广阔的应用前景，如所制备的转基因动物，可作为模式动物研宄机体的发病机理和治疗方法；研宄基因结构与功能的关系及胚胎发育的调控机理；改良家畜、家禽的经济性状及抗病能力；保护濒危动物；作为医用蛋白的生物反应器等。
[0003]在哺乳类转基因动物的制备研宄中，目前已经建立了多种成熟的转基因技术，如原核显微注射技术，单精子显微注射技术，慢病毒介导的转基因技术，精子介导的转基因技术、体细胞克隆介导的转基因技术、干细胞介导的转基因技术等。但禽类由于其特殊的发育特性，无法直接参照哺乳动物的转基因技术体系进行操作，所以无论是国内还是国外，禽类的转基因研宄仍比较滞后。
[0004]目前，禽类的转基因的制备方法主要有胚盘下腔注射慢病毒法以及原始生殖细胞(PGCs)介导法。而慢病毒以其特有的优势所建立起的胚盘下腔注射法制备转基因家禽的技术体系成为目前制备转基因家禽最主要的一种方法。因此，提高慢病毒对胚盘细胞的感染效率，对于实现高效的转基因家禽制备体系至关重要。
【发明内容】
[0005]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法的技术方案。
[0006]所述的一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法，其特征在于包括以下步骤:
1)种蛋的消毒:选取新鲜种蛋消毒处理后在室温下进行温度平衡；
2)慢病毒稀释:取慢病毒保存液，将病毒液使用DMEM稀释至0.5-3 X 109TU/ml ；
3)胚盘下腔显微注射:切割步骤I)得到的种蛋的蛋壳，将种胚倒入玻璃蒸发皿中，取显微注射针进行标记，吸取步骤2)得到的病毒稀释液，每枚胚胎注射1-5PL的病毒稀释液，每枚种胚注射量一致；
4)胚胎的转壳:将注射病毒后的种胚转入一稍大蛋壳中，薄膜封口；
5)种胚的温度控制处理:种胚完成转壳，进行正式孵化前，分别放置于12-16°C、20-25°C、28-33°C中进行静置，每个温度下静置时间为1_2天；
6)种胚的孵化:将种胚放置于38°C，相对湿度60%的孵化箱中进行正常孵化，每隔2h，90度角转蛋一次，孵化至第3天，第2次转壳，每隔2 h，30度角转蛋一次，孵化出雏。
[0007]所述的一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步骤I)中选取新鲜种蛋使用0.1%的新洁尔灭浸泡消毒后，75%的酒精擦拭表面，室温平衡2h。
[0008]所述的一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步骤2)中将病毒液使用DMEM稀释至1.0-2.5X 109TU/ml。
[0009]所述的一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步骤3)中每枚胚胎注射2_4μ?的病毒稀释液。
[0010]所述的一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步骤4)中种胚完成转壳，进行正式孵化前，分别放置13-15°C、21-23°C、30-32°C中进行静置。
[0011]本发明在慢病毒胚盘下腔注射后，完成第一次转壳，胚胎正式孵化前通过温度控制，延长慢病毒与胚盘细胞的接触时间，增加病毒的感染率，从而提高转基因家禽的制备效率。
【附图说明】
[0012]图1为胚盘下腔注射慢病毒法制备转基因家禽操作流程；
图2为转基因鸡胚荧光显微镜进行观测；
图3为不同温度下病毒感染效率比较。
[0013]图2中:A组:绿色荧光蛋白在脑部区域的表达出组:绿色荧光蛋白在翅膀部位的表达；(:组:绿色荧光蛋白在头部区域的表达山组:绿色荧光蛋白在腿部区域的表达出组:绿色荧光蛋白在脊柱中的表达^组:体视镜下全胚绿色荧光蛋白的表达。
[0014]图3中:38°C为正常孵化的对照组；12_16°C放置后转染效率可提高约2倍；20-24°C放置后转染效率可提高约4倍；28-33 °C放置后转染效率可提高约6倍。
【具体实施方式】
[0015]以下结合实施例来进一步说明本发明。
[0016]实施例1:一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法(如图1所示)
1)选取新鲜种蛋，使用0.1%的新洁尔灭浸泡消毒，75%的酒精擦拭表面，室温平衡2h ;
2)取含有绿色荧光蛋白的慢病毒(CSI1-EF-MCS-1RES2-Venus)保存液，病毒效价不低于 109，将病毒液使用 DMEM 稀释至 0.5-3X 109TU/ml，优选为 1.0-2.5X 109TU/ml ；
3)将准备好的蛋壳进行切割，将种胚倒入一玻璃蒸发皿中，取一显微注射针进行标记，使用微量注射系统吸取病毒液，每枚种胚注射1_5 KL的病毒稀释液，优选为注射2_4μ?，每枚种胚注射量一致；
4)将注射病毒后的种胚转入一稍大蛋壳中，薄膜封口；
5)种胚完成转壳，进行正式孵化前，分别放置于12-16°C、20-25°C、28-33°C进行静置，每个温度下静置时间为1-2天，优选为分别放置于13-15°C、21-23°C、30-32°C进行静置，每个温度下静置时间为I天，延长病毒与胚盘细胞的接触时间； 6)将种胚放置于38°C，相对湿度60%的孵化箱中进行正常孵化，每隔2 h，90度角转蛋一次，孵化至第3天，第2次转壳，每隔2 h，30度角转蛋一次，孵化至第5天，荧光显微镜下观测绿色荧光的表达，并使用流式细胞仪测定转入绿色荧光蛋白细胞的比例，如图2所示，A组:绿色荧光蛋白在脑部区域的表达；B组:绿色荧光蛋白在翅膀部位的表达；C组:绿色荧光蛋白在头部区域的表达；D组:绿色荧光蛋白在腿部区域的表达；E组:绿色荧光蛋白在脊柱中的表达^组:体视镜下全胚绿色荧光蛋白的表达。如图3所示，通过比较，38°C为正常孵化的对照组；12_16°C放置后转染效率可提高约2倍；20-24°C放置后转染效率可提高约4倍；28-33 °C放置后转染效率可提高约6倍。
【主权项】
1.一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法，其特征在于包括以下步骤: 1)种蛋的消毒:选取新鲜种蛋消毒处理后在室温下进行温度平衡； 2)慢病毒稀释:取慢病毒保存液，将病毒液使用DMEM稀释至0.5-3 X 109TU/ml ； 3)胚盘下腔显微注射:切割步骤I)得到的种蛋的蛋壳，将种胚倒入玻璃蒸发皿中，取显微注射针进行标记，吸取步骤2)得到的病毒稀释液，每枚胚胎注射1-5PL的病毒稀释液，每枚种胚注射量一致； 4)胚胎的转壳:将注射病毒后的种胚转入一稍大蛋壳中，薄膜封口； 5)种胚的温度控制处理:种胚完成转壳，进行正式孵化前，分别放置于12-16°C、20-25°C、28-33°C中进行静置，每个温度下静置时间为1_2天； 6)种胚的孵化:将种胚放置于38°C，相对湿度60%的孵化箱中进行正常孵化，每隔2h，90度角转蛋一次，孵化至第3天，第2次转壳，每隔2 h，30度角转蛋一次，孵化出雏。
2.如权利要求1所述的一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步骤I)中选取新鲜种蛋使用0.1%的新洁尔灭浸泡消毒后，75%的酒精擦拭表面，室温平衡2h。
3.如权利要求1所述的一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步骤2)中将病毒液使用DMEM稀释至1.5-2.5X 109TU/ml。
4.如权利要求1所述的一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步骤3)中每枚胚胎注射2-4μ?的病毒稀释液。
5.如权利要求1所述的一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法，其特征在于所述的步骤4)中种胚完成转壳，进行正式孵化前，分别放置13-15°C、21-23°C、30-32 °C中进行静置。
【专利摘要】一种提高慢病毒胚盘下腔注射制备转基因家禽效率的方法，属于生物技术领域。其包括以下步骤：1）种蛋的消毒；2）慢病毒稀释；3）胚盘下腔显微注射；4）胚胎的转壳；5）种胚的温度控制处理；6）种胚的孵化。本发明在慢病毒胚盘下腔注射后，完成第一次转壳，胚胎正式孵化前通过温度控制，延长慢病毒与胚盘细胞的接触时间，增加病毒的感染率，从而提高转基因家禽的制备效率。
【IPC分类】A01K67-027, C12N15-89
【公开号】CN104789599
【申请号】CN201510171588
【发明人】于福先, 潘建治, 朱志伟, 陈晓宇, 黄菁, 石铭
【申请人】浙江省农业科学院
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月13日