一种通过基因打靶技术生产人血清白蛋白的载体及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体的，涉及一种通过基因打靶技术生产人血清 白蛋白的载体及方法。
【背景技术】
[0002] 基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的一项技术，主要原理是外源DNA序列 与受体细胞内染色体上同源的DNA序列之间可以发生同源重组，该技术可以对基因组进行 定点的精细修饰。2000年，第一例体细胞基因打靶克隆羊诞生之后，体细胞基因打靶技术结 合核移植技术被广泛应用于对大动物基因组进行定点的精细修饰。
[0003] 人血清白蛋白是一种医疗上大规模使用的药用蛋白，每年全世界市场需求600吨 左右，市场价值大约30亿美元。临床上使用的人血清白蛋白主要是通过血液分级过滤得到 的，不仅价格较高（~5美元/g)，而且产能不能够满足世界市场的需求。自1981年首次从 人肝脏cDNA文库中克隆得到人血清白蛋白基因cDNA全序列以来，人们一直在尝试利用基 因工程技术在不同的物种中高效表达重组人血清白蛋白，取得了一定的进步，但是仍然受 困于表达量不够高，高度纯化比较困难等难题。尽管国内外已经有很多的研宄单位高效表 达了人血清白蛋白，部分物种中人血清白蛋白的表达水平也很高，但是目前为止，很少能将 研宄成果真正转化为生产成果。
[0004] 利用转基因动物作为生物反应器生产药用蛋白早已取得成功并得到大家的认可， 家猪在个体大小、器官遗传学、解剖学、营养代谢等方面与人类很接近，猪血清白蛋白与人 血清白蛋白的氨基酸同源性高达75. 6 %，二者功能相同，结构类似，在成年个体血液中的含 量均在30~50g/L。
[0005] 因此有必要开发一种基因打靶载体，通过基因打靶技术将人血清白蛋白的cDNA 精确替换猪血清白蛋白基因。从而利用猪血液作为生物反应器表达人血清白蛋白，而不表 达其自身的猪血清白蛋白，以利于从猪的血液中高效分离纯化人血清白蛋白。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的在于提供一种基因打靶载体及其构建方法。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供利用所述基因打靶载体或其构建方法生产人血清 白蛋白的方法。
[0008] 本发明的第三个目的在于提供一种血清白蛋白基因替换动物的生产方法。
[0009] 为达到本发明的第一个目的，本发明提供了一种基因打靶载体，所述基因打靶载 体包括人血清白蛋白基因、正筛选基因、负筛选基因和猪血清白蛋白基因的5'同源臂和3' 同源臂，其中，所述正筛选基因的两端具有重组酶识别序列。
[0010] 其中，所述人血清白蛋白基因的核酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0011] 可选的，所述正筛选基因为编码新霉素磷酸转移酶、潮霉素B磷酸转移酶、次黄嘌 呤磷酸核糖转移酶或嘌呤霉素乙酰转移酶的基因。
[0012] 可选的，所述负筛选基因是编码白喉毒素或胸腺去氧核苷的基因。
[0013] 可选的，所述重组酶识别序列为重组酶Cre识别序列或重组酶FLP的识别序列。
[0014] 可选的，所述5'同源臂的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，3'同源臂的核苷酸序 列如SEQ ID No. 3所示。
[0015] 在本发明的一种优选的实施方式中，所述正筛选基因为编码新霉素磷酸转移酶的 基因；负筛选基因为编码白喉毒素的基因；所述重组酶识别序列为如SEQ ID No.4所示的 重组酶Cre识别序列Loxp的核苷酸序列。
[0016] 其中，本发明所提供的方法通过在正筛选基因两侧引入重组酶识别序列，可以在 该基因打靶载体的使用过程中方便的将标记基因删除，从而可以完全去除标记基因对动物 体可能造成的影响。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述正筛选基因Neo与其两端的重组酶识别Loxp序 列构成正筛选元件，所述正筛选元件的一端与人血清白蛋白基因cDNA连接，另一端与所述 猪血清白蛋白基因的3'同源臂连接，所述人血清白蛋白基因cDNA的一端与所述猪血清白 蛋白基因的5'同源臂连接，在所述猪血清白蛋白基因的3'同源臂的外侧还连接有负筛选 基因。
[0018] 本发明中构建的基因打靶载体，采用的是正负筛选策略，因此能够在较大程度上 排除随机整合的细胞，提高打靶细胞富集效率。
[0019] 本发明所提供的基因打靶载体能够将猪血清白蛋白基因的第一外显子、第一内含 子和第二外显子的基因序列替换为人血清白蛋白基因CDNA，从而达到蛋白功能替换的目 的。
[0020] 本发明提供所述基因打靶载体的构建方法，包括以下步骤：第一步，将人血清白蛋 白cDNA进行高保真酶K0D-PCR扩增后在其3'端引入Xhol和Notl酶切位点，将正筛选元 件从PL452质粒上用Sail和Notl双酶切连接到人血清白蛋白cDNA之后；第二步，将猪血 清白蛋白基因的5'同源臂和3'同源臂从包含猪血清白蛋白基因座的BAC上通过基因抓捕 方法构建到含有负筛选基因的PBR322骨架载体上获得基因打靶骨架载体；第三步，将人血 清白蛋白cDNA以及正筛选元件通过基因抓捕的方法定点插入第二步构建的基因打靶骨架 载体上，完成载体构建。
[0021] 其中基因抓捕方法的原理可以参阅李宁主编的《高级动物基因工程》第七章"利用 基因抓捕技术构建打靶载体"部分（全书第306页）。
[0022] 本发明在构建基因打靶载体时，采用的是基因抓捕技术构建载体，基因抓捕技术 是利用细菌体内的同源重组发展出来的一项技术，该技术效率高、操作简单、不依赖酶切连 接，提高了基因打靶载体构建的效率。
[0023] 本发明提供了利用所述基因打靶载体或其构建方法在猪的血液中生产人血清白 蛋白的方法，包括利用所述基因打靶载体制备转基因猪，在转基因猪的血液中表达人血清 白蛋白。
[0024] 为达到本发明的第三个目的，本发明还提供了一种生产人血清白蛋白的转基因猪 的制备方法，所述方法包括利用所述基因打靶载体转染猪胎儿成纤维细胞替换猪血清白蛋 白基因。
[0025] 其中，被敲除替换的猪血清白蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。
[0026] 转基因猪的制备方法的步骤包括（1)细胞转染、筛选和鉴定：将基因打靶载体线 性化之后转染原代猪胎儿成纤维细胞，进行细胞筛选，经过PCR鉴定得到阳性细胞；（2)体 细胞核移植：将阳性细胞作为供体细胞注入去核卵母细胞使二者融合，体外构建重构胚胎； (3)胚胎移植获得基因克隆打靶猪杂合子；(4)基因打靶克隆猪杂合子公猪和母猪经过交 配后生产的猪鉴定后得到基因克隆打靶猪纯合子。本发明的技术路线示意图请参见图1。
[0027] 利用本发明所提供的打靶载体可以实现基因打靶克隆猪纯合子的血液中只表达 人血清白蛋白，不表达猪自身的血清白蛋白，利于后续从猪的血液中高效分离纯化人血清 白蛋白；从而为利用猪的血液作为生物反应器生产人血清白蛋白的研宄和产业化应用提供 支持。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明技术路线示意图。
[0029] 图2为本发明基因替换打靶载体构建流程图。
[0030] 图3为本发明基因替换打靶载体酶切鉴定图，图中，M为15kb DNA marker ;1为 Pml I单酶切片段，条带大小为20517bp;2为Pml I和Acc65 I双酶切片段，条带大小分 别为1990bp、6111bp、12416bp ;3为Pml I和Xho I双酶切片段，条带大小分别为4388bp、 5271bp、10858bp。
[0031] 图4为阳性细胞的PCR鉴