因组突变的直接检测、产前基因诊断、其它涉及有限的DNA投入(input)和高精确率的遗传诊断。
[0032]根据本文一些实施方案的测序，可以允许与之前的方法相比精确度>10，000倍高的单个细胞基因组测序。一些实施方案利用在单个双链核酸的沃森和克里克链中(例如在染色体中)编码的冗余遗传信息来克服体外扩增错误的问题。链及其互补链能够各自进行测序，并且两条链的序列能够进行比较。如果在两条链的确定序列之间存在差异，这种差异是更可能代表体外测序错误而不是真正的突变。在一些实施方案中，所述链的序列与参考序列进行比较。如果两条序列链彼此一致，但与参考序列不同，所述链最可能含有相对于参考序列的突变或变异。示例性的突变或变异包括但不限于:单个核苷酸多态性(SNPs)、缺失、插入、重复和倒位。在一些实施方案中，所述参考序列是来自相同生物的不同细胞。在一些实施方案中，所述参考序列是来自不同的、相关生物的细胞(例如，相同物种的生物或系统发育相关的物种的生物)。
[0033]在一些实施方案中，提供了允许单个哺乳动物细胞的基因组测序的?10_1(1的共有(consensus)错误率以对单个人类细胞直接测量体细胞突变的技术。
[0034]为此，在一些实施方案中提供了SISSOR(Single-Stranded Sequencing usingmicrOfluidic Reactors，采用微流控反应器的单链测序)。SISSOR利用在单个细胞的沃森和克里克链中编码的冗余遗传信息来克服体外扩增错误的问题。SISSOR可以包括分开单个细胞中的双链核酸分子的两条互补链用于独立扩增和测序，和采用来自沃森和克里克链的冗余测序数据从数以千计至数以万计的测序错误中区分每个基因组几十个真正的突变。理论上，在根据本文的一些实施方案的SISSOR中，当DNA的两条互补链以10_6的错误率在体外分别进行扩增时，人们能够实现10_12的错误率，并且仅当来自两条链的测序数据一致时所述突变被识别。基于另外的错误源，包括嵌合序列、测序仪器的硬件噪音和计算作图错误，根据本文的一些实施方案，10_1(1的错误率是可以实现的。从DNA分子的两条沃森和克里克链获得序列信息的概念常常被用于细菌克隆的Sanger测序中，如在人类基因组计划中人类参考基因组的产生。最近，相关概念被应用与第二代测序技术的精确度的改进(Schmitt et al.2012)。但是，就申请人所知道的，本文的实施方案代表了基于创新的微流控平台在单个细胞上第一次实现单链测序。
[0035]测序方法
[0036]根据一些实施方案，提供了对来自单个细胞的双链核酸进行测序的方法。所述方法可以包括从所述细胞分离多个双链核酸、分开双链核酸的链。所述方法可以包括将所述链置于多个溶液中，其中所述多个溶液中每一个与每个其它溶液分开，其中所述多个溶液中每一个具有大约4nl或更少的体积，并且其中在每个溶液中链的数量基本上类似。所述方法可以包括对所述链进行测序。
[0037]各种双链核酸可以被用于根据本文的实施方案，例如DNA、RNA或DNA-RNA杂交体。可被用于根据本文的实施方案的示例性的双链核酸包括染色体、小型染色体(minisome)、游离体(episome)、质粒或任何所列项的片段。虽然在本文的几个示例性的实施方案中讨论了染色体，本领域技术人员可以很容易地认识到其它双链多核苷酸可以被用于根据本文所公开的方法和组合物。在一些实施方案中，所述片段具有至少大约10kb的长度，例如大约 100kb、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10，000,20, 000,30, 000 或 40，OOOkb0
[0038]各种类型的单个细胞可以被用于根据本文的实施方案，例如，神经元、神经胶质细胞、生殖细胞、配子、胚胎干细胞、多能(pluripotent)干细胞(包括诱导的多能干细胞)、成人干细胞、造血谱系的细胞、多细胞生物的分化的体细胞、微生物细胞、癌细胞(包括例如癌症干细胞)、疾病的细胞等。
[0039]图4是表示根据本文的一些实施方案的对单个细胞的双链核酸进行测序的方法的流程图。所述方法可以包括分离单个细胞的多个双链核酸，其中所述多个中每一个双链核酸可以包含核酸第一链和核酸第二链，并且所述核酸第一链和核酸第二链彼此互补400。所述方法可以包括将所述多个双链核酸中每个双链核酸的所述核酸第二链与所述核酸第一链分离410。所述方法可以包括将所述多个染色体的所述第一链和第二链置于多个溶液中，其中所述多个溶液中每一个与每个其它溶液分开，并且其中所述多个溶液中每一个具有大约4nl或更少的体积，并且其中在每个溶液中的链的数量基本上类似420。所述方法可以包括扩增每条链430。在一些实施方案中，每条链被扩增不超过大约10，000倍，例如不超过大约1，000倍。所述方法可以包括对每条链进行测序440。在一些实施方案中，所述方法包括互相比较两条互补链的序列450。在一些实施方案中，所述方法包括将所述互补链的序列与参考序列进行比较460。在一些实施方案中，在单个微流控装置中进行整个方法。在一些实施方案中，在单个微流控装置中贯穿整个扩增实施所述方法430，在该点核酸的链被从微流控装置中取出，并用于构建测序文库。本领域技术人员应当理解的是，对于本文所公开的该过程和方法与其它过程和方法，在所述过程和方法中进行的功能可用不同顺序进行。另外，所概述步骤和操作仅作为例子提供，而一些步骤和操作可以是可选的，被组合成更少的步骤和操作、或被扩展成另外的步骤和操作而不脱离所公开的实施方案的本质。
[0040]本领域技术人员将会认识到，根据本文的实施方案，各种技术可以被用于从所述细胞分离核酸。在一些实施方案中，所述细胞被裂解，例如通过冻融循环(例如，在液氮中)、将所述细胞与碱性溶液(例如，氢氧化钾、氢氧化钠或另一种合适的强碱性溶液)接触、或将细胞与盐溶液(如N-月桂酰肌氨酸盐)接触。
[0041]在一些实施方案中，将所述多个双链核酸(例如，染色体)的所述第一链置于多个溶液，包括分开所述链并将所述链在多个溶液中进行分配。所述链可以被通过各种方法分配，例如，机械旋转或被动扩散。各种方法可以被用于将所述链分开，例如，碱变性或热变性。因此，在一些实施方案中，碱性溶液是用来既从细胞中分离核酸又将核酸的所述链分开。
[0042]在一些实施方案中，所述链通过将所述互补链彼此分开而被分配，并且然后温和地机械旋转所述链。不被任何特定的理论限制，温和的机械旋转可以使得单链多核苷酸的剪切最小化。温和的机械旋转可以在旋转构件中进行。在一些实施方案中，进行混合涉及打开和关闭与所述旋转构件流体连通的多个阀。在一些实施方案中，所述旋转构件包含环。在一些实施方案中，所述链被彼此分开，并且然后被置于所述旋转构件中。在一些实施方案中，所述链被置于所述旋转构件中，并且然后被彼此分开。机械旋转之后，所述链可以被在多个溶液中分配。
[0043]在一些实施方案中，通过将所述互补链彼此分开而分配所述链，并且然后被动扩散所述链进入多个溶液。在一些实施方案中，所述链被置于被动扩散器中，其包含与所述多个溶液流体连通的被动扩散膜。在一些实施方案中，所述链首先彼此分开，并且然后被置于所述被动扩散器中。在一些实施方案中，所述链被置于所述被动扩散器中，然后彼此分开再扩散进入所述多个溶液。
[0044]通过在多个不同溶液中分配所述链，对于每条染色体(或其它双链多核苷酸)，所述互补的核酸在分开的溶液中的可能性可非常高。在一些实施方案中，对于每条染色体，所述互补的核酸在分开的溶液中的可能性为至少95%，例如大约95.1%,96%,97%,98%,99 %、99.5 %、99.9 %或99.99 %。对于所有双链多核苷酸的互补链在分开的溶液中的可能性可能取决于不同的双链多核苷酸的数量，其可以被单个细胞中的染色体数量和单个细胞的倍性所影响，并且因此，需要提供特定可能性的不同溶液数量可以不同。值得注意的是，通常，单个细胞中染色体(或双链核酸)的总数越低，所述链被分配使得所述互补核酸在分开的溶液中的可能性越高。在一些实施方案中，24个不同溶液提供相同的双链多核苷酸的两条链不在相同的溶液中的可能性大于95%。24个不同溶液能够确保对于二倍体人类基因组(23个染色体对)和二倍体小鼠基因组(19个染色体对)该至少95%的可能性，注意的是，由于二倍体小鼠比二倍体人类具有更少的染色体，对于二倍体小鼠，所述可能性会比二倍体人类稍微更高。在一些实施方案中，有至少10个不同溶液，例如，10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、、60、70、80、90 或 100 个不同溶液。在一些实施方案中，所述不同溶液被放置于微流控装置中。在一些实施方案中，所述不同溶液与如本文所述的构件流体连通。
[0045]在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有4nl或更少的体积，例如大约4nl、4nl、3.5nl、3nl、2.5nl、2nl、l.5η1、1η1、0.5η1、0.4η1、0.3η1、0.2η1、0.1η1、0.09η1、0.05η1和0.0lnl，包括所列值的任意两个之间的范围。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有2nl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有Inl或更少的体积。在一些实施方案中，所述多个溶液中每一个具有0.4nl或更少的体积。
[0046]在一些实施方案中，所述测序包括在所述溶液中对每条链进行扩增。在一些实施方案中，所述扩增包括多重置换扩增。不被任何特定的理论限制，已经可以在本文中观察到大约1000倍或更少的每条链的扩增产生沿着每个核酸非常均一的扩增(参见例如图1和3)。此外，不被任何特定的理论限制，虽然1000倍的扩增产生相对于大基因组(如人类和小鼠)非常均一的扩增，本文包括对于更小基因组可以用基本上更高倍数的扩增产生均一性。因此，在一些实施方案中，每条链被扩增不超过大约10，000倍，例如，不超过大约10，000 倍、9000 倍、8000 倍、7000 倍、6000 倍、5000 倍、4000 倍、3000 倍、2000 倍、1500 倍、1400 倍、1300 倍、1200 倍、1100 倍、1000 倍、950 倍、900 倍、850 倍、800 倍、750 倍、700 倍、650倍、600 倍、550 倍、500 倍、450 倍、400 倍、350 倍、300 倍、250 倍、200 倍、150 倍、或 100 倍。在一些实施方案中，测序包括扩增每条链大约100倍一 1000倍、大约200倍一 1000倍、大约300倍一 1000倍、大约400倍一 1000倍、大约500倍一 1000倍、大约600倍一 1000倍、大约700倍一 1000倍、大约800倍一 1000倍、大约900倍一 1000倍、大约950倍一 1000倍、大约100倍一 900倍、大约200倍一 900倍、大约300倍一 900倍、大约400倍一 900倍、大约500倍一 900倍、大约600倍一 900倍、大约700倍一 900倍、大约800倍一 900倍、大约100倍一 800倍、大约200倍一 800倍、大约300倍一 800倍、大约400倍一 800倍、大约500倍一 800倍、大约600倍一 800倍或大约700倍一 800倍。
[0047]期望的倍数扩增可以通过各种方法实现，例如反应体积、试剂的选择、试剂的浓度、反应条件(如温度等)和反应时间。在一些实施方案中，反应时间被用于控制所述倍数扩增。在一些实施方案中，每条链被扩增不超过24小时，例如大约24小时、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 I 小时。对于许多应用(例如，用于许多基因组大小)，扩增不超过5小时可能是合适的，但是本领域技术人员应当理解的是，这可