将真的突变与假阳性区分。在一些实施方案中，所述旋转元件(例如，混合环)和扩增室确保分隔的平均和/或随机。在一些实施方案中，所述装置的内表面涂有非粘性聚合物(如PEGs)以防止非特异性DNA结合。在一些实施方案中，通道和室的几何形状被优化以避免死体积。在一些实施方案中，基因组测序文库是由纳克级的MDA扩增子构建的。
[0064]—些实施方案包括基于DNA聚合酶I去分支和Tn-5转座子Tagmentat1n的操作步骤。该操作步骤比公开的方法有效>10χ，并且获得具有>10χ更高的复杂度的测序文库。在一些实施方案中，存在针对每个室的测序文库，使得单个细胞产生等于室的数量的许多测序文库(例如，如果有24个室，则能够有24个测序文库)。因此，随着更多的单个细胞被测序，该实验的规模会迅速增长。因此，在一些实施方案中，该文库制备操作步骤采用液体处理机器人进行自动化，以确保从所述微流控装置洗脱出的每个单个扩增子被转换成相应一致的测序文库。
[0065]本文一些实施方案的示例性应用包括癌症中稀有突变的早期检测，以及涉及非常有限的投入(input)材料和需要高度精确测序的其它遗传诊断应用。
[0066]在一些实施方案中，用于单个哺乳动物细胞的高精确度基因组测序的方法和/或设备(apparatus)本身将是一个重大的技术进步。在一些实施方案中，该技术被应用于表征成人脑中单个神经元的体细胞基因组多样性，其是很少被探索的领域，并可能会导致我们在理解成人脑和脑部疾病的神经元功能多样性的模式转变。
[0067]实施例1:文库制备
[0068]低投入(low-1nput)文库制备方法，开始于制备Iul从微流控装置中冲洗出来的MDA扩增子。首先，将超支化的MDA扩增子转化成双链平端的DNA。为此，1.5ul的碱性变性缓冲液(400mM KOH, 10mM DTT, 1mM EDTA)被加至所述Iul MDA扩增子，并且反应在室温下孵育3分钟，并转移至冰上。用1.5ul的中和溶液(400mM HCl, 600mM Tris.HCl, pH 7.5)中和反应。然后加入2ul 1x DNA聚合酶I缓冲液、Iul 1mM dNTP、5ul 20uM随机六聚体、7ul无核酶的H20和Iul DNA聚合酶I (10U/ul)。反应在37°C孵育I小时，并在65°C灭活10分钟。通过乙醇沉淀来纯化所得到的双链平端的DNA，并且将其重悬于1ul H20中。
[0069]接下来，通过Nextera Tagmentat1n (Epicentre)将所述双链平端的DNA转换成Illumina测序文库。简而言之，将7ul的DNA与2ul的5x HMW缓冲液(Epicentre Nexterakit)和 1:50 稀释的转座酶(transposase) (Epicentre Nextera kit)进行混合，并在 55°C孵育反应5分钟。然后，加入Iul 1:100稀释的蛋白酶(Qiagen)，并且反应在50°C孵育10分钟，以及70°C孵育20分钟。接下来，加入Iul没有外切酶活性的Klenow片段(10U/ul，NEB)和Iul 1mM dNTP，并在37°C孵育15分钟。将Tagmentat1n方法所得到的DNA(13ul)在50ul 的 IX KAPA Robust PCR Master Mix 与 200nM 的 Nextera 引物混合物和 0.4x SybrGreen I中，采用以下的热循环操作步骤进行PCR扩增:95°C 30秒，接着15个循环的95°C 10秒、62°C 15秒和72°C 2分钟。在实时热循环仪上监测该反应，并在扩增曲线刚刚达到平台期时终止反应。所得到的PCR扩增子用Agencourt AmPure磁珠进行纯化并提交测序。
[0070]实施例2:单个小鼠成纤维细胞的基因组测序
[0071]采用如本文图1B中所述的原型装置对单个小鼠胚胎成纤维细胞成功进行了实验。进行如实施例1中所述的操作步骤。所述操作步骤对完整的小鼠基因组实现了相当平均(even)的扩增(图1C)。
[0072]实施例3:表征在成人脑和体外(in vitro)分化的神经元中的体细胞基因组多样性
[0073]表征在成人脑和体外分化的神经元中的体细胞基因组多样性。累积的证据表明，在成人脑中存在基因组嵌合体，并且可能针对细胞类型、脑功能区域以及甚至某些脑疾病的状态是特异性的。采用SISSOR技术，表征了人类死后的脑中的基因组多样性的程度(大区域的单核苷酸变化和拷贝数变化)。
[0074]全面表征了人类死后的脑中单个神经元上单核苷酸分辨率上的体细胞基因组多样性。一个重点是前额叶皮层的神经元，因为现有证据表明这样的神经元倾向于展示获得的总 DNA 含量。Westra, J.W.，et al.(2010) “Neuronal DNA content variat1n (DVC)with reg1nal and individual differences in the human brain.J Comp Neurol518:3981-4000，其全部公开内容通过引用并入本文。在成人脑中神经元是高度并紧密彼此连接的。申请人不知道之前的允许从死后的脑切片分离单个完整的神经元的技术。采用免疫染色、显微解剖和流式分选的组合，特异性针对SCISSOR分离神经元的细胞核。简而言之，对?20 ym厚的脑切片进行激光捕获以从特定层收获?10，000个细胞(即，LayerIVc)，其中一个特定神经元细胞类型(即星形中间神经元)易于识别和占优势。将所捕获的细胞温和裂解、用NeuN抗体染色以特异性标记神经元细胞核并进行流式分选。单个NeuN+细胞核会被加载至我们的微流控芯片用于DNA链分离、分隔(partit1n)和扩增。首先对每个测序文库进行突变识别，将来自所有24个基因组子集的候选突变组合以鉴定真正的突变。24个数据集的覆盖深度也会被组合，用于鉴定大基因组区域的获得或丢失。Zhang, K.，et al.(2006) “Sequencing genomes from single cells by polymerasecloning.Nat.B1technol 24:680-686，其全部公开内容通过引用并入本文。在相同皮层切片中的神经胶质细胞的细胞核(NeuN-)和来自相同脑的小脑的NeuN+细胞核用作对照，基于这些细胞倾向于具有正常的总DNA含量的现有证据。预计可以鉴定单核苷酸和大染色体片段的体细胞遗传变化。该实验可以表明:(i)在三种类型的单个细胞中体细胞突变的频率和相同类型的不同细胞中的变异性是什么；(ii)所述突变的基因组位置是什么，以及是否存在基因组位置、表观遗传学状态、基因或通路方面任何富集；(iii)突变的什么部分在不同类型或相同类型的细胞中共享？
[0075]实施例4:体细胞基因组变化起源的鉴定
[0076]这样的体细胞基因组变体的起源，通过检查在从人多能干细胞体外分化为神经元过程中单个细胞基因组的完整性进行鉴定。
[0077]在单个神经元中通过分析由人多能干细胞体外分化的神经元和神经元前体来鉴定体细胞突变的来源。具体地，该方法可以区分两个假设:(i)突变是胚胎发育早期由神经元分化和细胞命运决定过程中积累的；(ii)突变发生于有丝分裂后的成年神经元中，并且可能直接或间接与功能性神经元活动有关。用于来自人胚胎干细胞和游离体再编程hiPS细胞的神经元干细胞进行体外分化的示例性操作步骤，可参见Yuan，S.H.，etal.(2011) “Cell-surface marker signatures for the isolat1n of neural stemcells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.，，PLoS One6:el7540和 Israel et al.(2012)Probing sporadic and familial Alzheimer’s diseaseusing induced pluripotent stem cells.Nature 482:216-220 中，其每一篇的全部内容通过引用并入本文。采用活细胞成像和在我的组中最近建立的显微操作系统，进行细胞追踪，并且提取单个细胞。这些单个细胞通过用于单个细胞全基因组测序的确定数量的细胞分裂进行分离。在第一种假设下，预计观察到在细胞之间共享的突变。基于突变共享的程度，能够构建与发育层次结构一致的谱系树。此外，大多数突变应该在没有显著功能性富集的随机位置发生。另一方面，如果第二种假设是真的，应该在在发育谱系中彼此非常接近的细胞间存在很少或没有共享的突变。与来自死后的脑的神经元相比，如果在有丝分裂后发生突变形成，预计可在体外分化的静息神经元中观察到显著低水平的突变载荷。最后，如果突变形成是活动相关的，在相同功能性皮层区的神经元中可能观察到某些基因组区域或通路中的突变富集。
[0078]实施例5:对正常成人脑和体外分化的神经元进行另外的测序
[0079]对正常成人脑和体外分化的神经元进行另外的测序。研宄了来自神经退化性疾病的患者的脑标本。如果某些基因组区域或通路通常在体内(in vivo)突变，可以在随访中进行功能性后果的表征。单个细胞测序可以原位(in situ)进行，例如以将体细胞突变作图至脑的三维解剖结构。
_0] 实施例6:单个人成纤维细胞的基因组测序
[0081]将人成纤维细胞加载至微流体处理器，并且在单个细胞捕获模块中捕获(trap)一个单个细胞。洗涤之后，用碱性缓冲液裂解细胞，并且将细胞内容物移至旋转构件，其中通过碱变性和温和机械搅拌的组合作用解离所有染色体的双链DNA(注意在V9设计中，该完整步骤在变性室中没有机械搅拌的情况下进行以使DNA片段化最小化)。大的单链DNA片段被随机分隔至24个0.4nL体积的下隔室(lower compartment)，并且在24个上隔室的每一个中用中和溶液进行混合。然后每个隔室中中和的DNA溶液被推送至MDA反应室，并与23nL体积的扩增反应混合物进行混合。在24个扩增室中平行地进行过夜扩增，然后扩增子流出并被收集至单个的0.2mL PCR管用于构建Illumina测序文库(注意在V9设计中，对变性室中保留的DNA分子进行另外的扩增。因此，每个单个细胞总共收集25个扩增子)。每个扩增子被转换成用独特的DNA条形码标记的文库，并且所有24个测序文库被汇集(pooled)用于在Illumina GA IIx or HiSeq2500测序仪上进行测序。测序读出结果按照BWA/GATK最佳实践V4与人类基因组参考序列进行比对。在bam格式文件中比对的测序读出结果用SeqMonk进行可视化。代表性的结果如图3所示。值得注意的是，虽然对完整的人类基因组进行了测序，图3中仅示出了一个代表性的染色体19的2.5兆碱基的区域。
[0082]文献列表
[0083]以下文献在此通过引用并入本文用于所有目的:
[0084]现有的用于单个细胞扩增和测序的方法的错误率为?10_5.Lasken RS, DeanFB, Nelson J(2000)Multiply-primed amplificat1n of nucleic acid sequences.USPatent#6323009
[0085]Zhang Kj Martiny AC，Reppas NB, Barry KWj Malek J，Chisholm SWj ChurchGM.(2006)Sequencing genomes from single cells by polymerase cloning.NatureB1technology 24:680-686
[0086]Church GM，Zhang K(2006)US Patent Appl#2006/0014167Amplificat1n oftrace amounts of nucleic acids.
[0087]Marcy Yj Ishoey T，Lasken RSj Stock