一种shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体、重组质粒及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于功能基因组学研究领域，涉及一种慢病毒RNAi载体、重组质粒及其构 建方法。
【背景技术】
[0002] RNA干扰（RNA interference, RNAi)是一种在进化过程中高度保守的，由双链 RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发同源mRNA高效特异性降解的基因转录后沉默现象 (Fire A. , Nature, 1998. 391 (6669) :p. 806-11.)。RNAi 技术不仅揭示了细胞内基因沉默机 制，是继酵母杂交系、DNA芯片、基因敲除、反义RNA等技术后的又一解读基因功能的有效研 究手段，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。RNA干扰在细胞中的作用机制分为三个 阶段：第一个是起始阶段，外源性或内源性双链RNA分子被细胞内的Dicer酶加工剪切成 21-25个核苷酸长度的小分子双链（small-interfering RNAs，siRNA);第二个是RISC的组 装阶段，产生的siRNA中其中一条链与Argonaute (Ago)及其相关蛋白组装形成具有活性 的沉默复合体RISC (RNA-induced silencing complex);第三个是效应阶段，组装形成的 具有活性的RISC作用于与其上的单链小分子RNA序列互补的mRNA，通过将该mRNA降解使 其翻译受到抑制，最终导致基因的沉默（Siomi，H. and M. C. Siomi，Nature, 2009. 457 (7228) :ρ·396-404)。
[0003] 但是，在RNAi的实际应用中经常发现，即使是合理设计的shRNA仍不能发挥有效 的干扰作用。经过分析，归纳出了影响shRNA干扰效果的几种因素：如驱动siRNA表达的启 动子、siRNA作用位点、多个siRNA的串联表达、siRNA与RISC的结合情况和干扰载体的转 染效率等（Dykxhoorn, D. M. and J. Lieberman, Annu Rev Biomed Eng, 2006. 8: P. 377-402)。
[0004] 针对上述问题，研究人员致力于发现增强ShRNA干扰效率的RNAi相关蛋白因子。 Ago2是Argonaute蛋白家族中唯一包含有切割活性的蛋白质。细胞内RNAi离不开Ago2的 参与（Juvvuna P.K·· Nucleic Acids Res, 2012. 40(14) :ρ· 6808-20)，Ago2 不仅可与 siRNA 结合，还可通过与miRNA结合从而提高成熟miRNA在细胞中的水平和稳定性（Ghildiyal M.and P.D. Zamore. Nat Rev Genet, 2009. 10(2): P. 94-108)。细胞内的 siRNA 和 miRNA 则 竞争性地与数量有限Ago2结合，外源导入siRNA可能会导致如下情况：一方面，细胞内大 多数Ag〇2可能被miRNA占据，外源导入的shRNA则可能由于没有足够的Ag 〇2来对其进行 装载，从而导致部分shRNA未能发挥作用就被降解；另一方面，研究表明siRNA、shRNA比 pre-miRNA在结合RISC方面存在优势，说明进入细胞的外源shRNA可能比miRNA优先占用 细胞内 RISC 即消耗Ago2 (Castanotto D. Nucleic Acids Res, 2007. 35(15) :ρ· 5154-64)，那 么内源性miRNA可能由于没有足够的Ago2对其进行装载而被降解，导致依赖miRNA途径的 细胞活动受到影响。因此，细胞内Ago2的可用数量不足，不仅会影响shRNA干扰作用的发 挥，也可能影响细胞内miRNA正常功能的运作。在维持细胞miRNA正常功能的前提下，细胞 内RNAi的效率很大程度上取决于可用Ag 〇2的数量。已经有研究证明，过表达Ag〇2蛋白可 以提高哺乳动物细胞内的RNAi效率。
[0005] Diederichs等通过将Ago2与shRNA共转染于HEK293细胞，检测细胞中的荧光 表达量发现Ago2能明显提高RNAi沉默效率（Diederichs S. Proc Natl Acad Sci U S A，2008. 105(27) :ρ· 9284-9)。Grimm等在小鼠中共同表达shRNA与Ago2,发现Ago2能明显 增强沉默效率并延长沉默时间，同时能降低shRNA给小鼠肝脏带来的毒性（Grimm，D. J Clin Invest, 2010. 120(9) :p. 3106-19)。但是，采用Ago2与shRNA共转染的方式导入到细胞难 以控制这两者之间的比例。针对这个问题，Chen等将shRNA和Ag 〇2构建在同一个表达载 体上，并将表达载体导入到非洲蟾蜍神经细胞中进行RNAi实验，结果表明该表达载体比普 通的shRNA在神经细胞中有更高的干扰水平（Chen, C. M. Front Neurosci, 2009. 3:P. 63.)。 但是，上述实验中shRNA表达载体在细胞中的转染效率不高，影响了 shRNA在细胞的高水平 表达；同时，上述技术都是进行载体的瞬时表达（即短时间表达)，难以维持shRNA的长时间 作用；另外，已有技术采用的基因表达功能元件的种类、结构和组合方式等条件非最佳，这 也阻碍了 shRNA干扰作用的有效发挥。因此，现有表达shRNA的技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明提供了一种shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体、重组 质粒及其构建方法，该载体引入细胞后可持续、高效的同时表达目的基因的shRNA和增强 因子Ago2。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 一种shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体，包含shRNA表达框和Ago2蛋白表达框， 所述shRNA表达框包含启动子U6、H1或7SK，以及ccdB致死基因；所述的Ag 〇2蛋白表达框 包含CMV强启动子、Ag〇2蛋白表达基因、内部核糖体进入位点DNA序列和ZsGreenl绿色荧 光蛋白表达基因。
[0009] 优选地，所述的ccdB致死基因的两端设有限制性酶切位点BamHI和MluI。
[0010] 一种shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体的构建方法，包括以下步骤：
[0011] (1)制备用于构建载体的骨架pLVX-IRES-ZsGreenl-Puro :
[0012] 以 pLVX-IRES-ZsGreenl 载体为模板，扩增得到 IRES-ZsGreenl 片段， 用Clal-Xbal双酶切PCR产物，然后通过相应的位点克隆到pLVX-Puro载体，得到 pLVX-IRES-ZsGreenl-Puro 载体骨架。
[0013] (2)插入增强因子Ago2基因表达框CMV_Ago2 :
[0014] 用 MluI 和 EcoRI 双酶切 pIRESne〇-FLAG/HA-Ag〇2 载体，得到 CMV-Ago2 片段，将 CMV-Ag〇2片段与步骤（1)回收的pLVX-IRES-ZsGreenl-Puro载体骨架连接，转入大肠杆菌 感受态细胞，涂LB平板，培养过夜，进行菌落PCR及酶切鉴定，得到的载体pLVX-CMV-Ag 〇2-IRES-ZsGreenl-Puro ；
[0015] (3)插入shRNA表达启动子：
[0016] 用 BclI 和 MluI 双酶切步骤（2)得到的载体 pLVX-CMV-Ago2-IRES-ZsGreenl-Puro ，去磷酸后电泳回收；用BclI和MluI双酶切扩增hU6、Hl或7SK启动子的PCR产物后，连接 到pLVX-CMV-Ago2-IRES-ZsGreenl-Puro载体的相应位点上，转入大肠杆菌感受态细胞中， 涂LB平板，培养过夜，鉴定后得到的载体为： PLVX-hU6/Hl/7SK-CMV-Ago2-IRES-ZsGreenl- Puro ο
[0017] (4)插入ccdB序列得到shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体：
[0018] 以pLenti6载体为模板，扩增出含有大肠杆菌ccdB致死基因的片段，将扩增的到 的ccdB用BamHI和Mlu I双酶切后，与经过BamHI和Mlu I双酶切的pLVX-hU6/Hl/7SK-C MV-Ago2-IRES-ZsGreenl_Puro载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞中，涂LB/amp+Chl双抗 平板，培养过夜，进行菌落PCR及酶切鉴定，得到shRNA-Ag 〇2共表达慢病毒RNAi载体，载体 骨架是 pLVX-hU6/Hl/7SK-ccdB-CMV-Ago2-IRES-ZsGreenl-Puro。
[0019] 在上述方案中，能够同时在同一载体上使用hU6、Hl或7SK启动子驱动shRNA的 表达，CMV启动子驱动Ag 〇2的表达和绿色荧光蛋白的表达。ccdB两端设有限制性酶切位 点BamHI和Mlul，用于构建和筛选含目的基因 shRNA阳性克隆的shRNA-Ag〇2共表达慢病 毒RNAi载体。增强因子Ag〇2的表达既保证了导入细胞的shRNA最大量地装载于沉默复合 体RISC、便于shRNA对其目的基因进行剪切、增强目的基因的沉默；同时也用于维持细胞内 miRNA介导的RNAi路径的正常进行，降低外源导入shRNA对细胞功能的影响。
[0020] 本发明还提供了一种shRNA-Ago2共表达慢病毒重组质粒，所述shRNA-Ago2共表 达慢病毒重组质粒包含上述的shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载体。
[0021] 优选地，所述shRNA-Ag〇2共表达慢病毒重组质粒还包含目的基因 shRNA，所述 shRNA的茎部长度为19~22bp，所述shRNA的loop长度是4~9bp。
[0022] 优选地，所述shRNA的茎部长度为20bp。
[0023] 优选地，所述shRNA的loop长度是6~9bp。
[0024] 优选地，所述shRNA的sense/antisense结构是从5'端开始的 sense-loop-antisense 结构。
[0025] 本发明还提供了一种shRNA-Ago2共表达慢病毒重组质粒的构建方法，包括以下 步骤：
[0026] 1)针对目的基因设计shRNA编码序列，化学合成两条引物，将两条引物退火形成 带限制性内切酶BamHI和MluI黏性末端的shRNA ;
[0027] 2)通过限制性内切酶BamHI和MluI消化上述shRNA-Ago2共表达慢病毒RNAi载 体骨架，酶切回收后，将载体骨架与退火的shRNA进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞并涂 板培养过