外，使用铯密度梯度超离心、蔗糖密度梯度超离心等超离心分离时，被分离纯化 的病毒的纯度极其高，病毒的感染滴度（TCID 5ciAiL)与杂质蛋白质浓度（ng/mL)的比变为 10000以上：1，杂质少，因此存在病毒颗粒容易聚集的问题。如果病毒颗粒聚集，则在生物 制剂的制造工序的病毒清除评价中，即便使用病毒本来能够通过那样的孔径的滤器，病毒 也会被分离去除，因此存在夸大地评价病毒清除的问题。
[0031] 进而，铯密度梯度超离心方法、蔗糖密度梯度超离心等超离心分离的技术，需要操 作极其复杂且难的熟练技术。进而，常用的超离心分离机的离心管的体积存在限速，所以扩 大规模是困难的，所以通常只能进行小规模的实验，产业上引入这些纯化工序是不现实的。
[0032] 另外，为了得到高感染滴度的病毒悬浮液，还已知有如下方法：回收感染细胞并重 复冷冻融解，强制地?物理地破坏细胞，从而将细胞内部蓄积的病毒回收。其是用小鼠微小 病毒等通常进行的病毒生产方法，然而该方法中，由于大量的宿主细胞内部的杂质混入，所 以即便得到了高感染滴度的病毒，由于杂质浓度相对地高，利用病毒时，也需要超离心纯化 等复杂的操作，存在同上的问题。
[0033] 这样，采用现有的病毒生产技术是极其困难的，期望不使用超离心分离等复杂的 操作而更简便且有效率地得到合适的纯度的高感染滴度的细小病毒溶液的方法。
[0034] 用于解决问题的方案
[0035] 本发明人等为了解决上述的课题，对于培养细小病毒的宿主细胞，向其中接种细 小病毒的种病毒，使细小病毒增殖的培养体系中的各条件（初始宿主细胞密度、感染复数 (MOI))与病毒感染滴度的关系，进行了深入研宄，结果发现：令人惊奇的是，使一直以来没 有采用的极低的特定范围的细胞密度的宿主细胞以特定范围的低MOI感染细小病毒的种 病毒，进而培养宿主细胞特定的期间，并回收培养上清，由此利用细小病毒特有的增殖机 理，得到了利用现有方法无法得到的感染滴度非常高的细小病毒溶液。
[0036] 即，本发明如下。
[0037] [1]
[0038] 一种高感染滴度的细小病毒的生产方法，其为通过在培养基材中培养宿主细胞和 细小病毒的种病毒，从而在培养上清中生产IO 8TCID5ciAiL以上的高感染滴度的细小病毒的 方法，其包括：
[0039] 工序（a)，事先分别算出所述培养中的宿主细胞的对数增殖期的倍增时间和汇合 增殖时的宿主细胞的细胞密度；
[0040] 工序（b)，向包含宿主细胞和培养基的前述培养基材以感染复数（MOI)成为 0. 0001~0. 1的方式接种细小病毒的种病毒的工序，所述宿主细胞的细胞密度为工序（a) 中事先算出的汇合增殖时的宿主细胞的细胞密度的1/500~1/20 ;
[0041] 工序（C)，对于工序（b)的包含宿主细胞和细小病毒的培养物以工序（a)中事先算 出的倍增时间的5~11倍的时间进行培养；和
[0042] 工序（d)，对于包含通过工序（C)的培养而得到的细小病毒的培养上清进行回收。
[0043] [2]
[0044] 根据[1]所述的方法，其中，前述宿主细胞为黏附依赖性细胞。
[0045] [3]
[0046] 根据[1]或[2]所述的方法，其中，前述宿主细胞为对细小病毒具有感受性的细 胞。
[0047] [4]
[0048] 根据[1]~[3]中的任一项所述的方法，其中，前述细小病毒为猪细小病毒（PPV)、 犬细小病毒（CPV)、小鼠微小病毒（MVM)、大鼠病毒（RV)、H-I病毒（H-I)、猫细小病毒 (FPV)、鹅细小病毒（GPV)或牛细小病毒（BPV)。
[0049] [5]
[0050] 根据[1]~[4]中的任一项所述的方法，其中，在前述工序（b)中，向包含宿主细 胞和培养基的前述培养基材以感染复数（MOI)成为0.0 OOl~0. 1的方式接种前述细小病 毒的种病毒，所述宿主细胞的细胞密度为工序（a)中事先算出的汇合增殖时的宿主细胞的 细胞密度的1/300~1/30。
[0051] [6]
[0052] 根据[1]~[4]中的任一项所述的方法，其中，在前述工序（b)中，向包含宿主细 胞和培养基的前述培养基材以感染复数（MOI)成为0. 0001~0. 1的方式接种前述细小病 毒的种病毒，所述宿主细胞的细胞密度为工序（a)中事先算出的汇合增殖时的宿主细胞的 细胞密度的1/200~1/40。
[0053] [7]
[0054] 根据[1]~[6]中的任一项所述的方法，其中，前述感染复数（MOI)为0.001~ 0. 03〇
[0055] [8]
[0056] 根据[7]所述的方法，其中，前述感染复数（MOI)为0. 003~0. 01。
[0057] [9]
[0058] 根据[1]~[8]中的任一项所述的方法，其中，前述培养基为血清培养基时，工序 (c)中包括将前述血清培养基更换为无血清培养基的工序。
[0059] [10]
[0060] 根据[1]~[9]中的任一项所述的细小病毒的生产方法，其中，前述工序（c)中， 以工序（a)中事先算出的倍增时间的6~9倍的时间进行培养。
[0061] [11]
[0062] 根据[10]所述的细小病毒的生产方法，其中，前述工序（c)中，以工序（a)中事先 算出的倍增时间的7~8倍的时间进行培养。
[0063] [12]
[0064] 根据[1]~[11]中的任一项所述的细小病毒的生产方法，其中，前述工序（c)中， 对前述培养物在33°C以上且39°C以下的温度下进行培养。
[0065] [13]
[0066] 根据[1]~[12]中的任一项所述的细小病毒的生产方法，其中，前述工序（c)中， 前述宿主细胞与前述病毒同时进行增殖。
[0067] [14]
[0068] 根据[1]~[13]中的任一项所述的方法，其中，前述工序（d)中包括以下去除工 序：将前述培养上清所包含的游离的宿主细胞和宿主细胞的碎片去除。
[0069] [15]
[0070] 根据[14]所述的方法，其中，前述去除工序使用孔径0.2 μπι~0.45 μπι的膜过滤 来进行。
[0071] [16]
[0072] -种培养液，其包括通过[1]~[15]中的任一项所述的方法而得到的IO8TCID 5tl/ mL以上的感染滴度的细小病毒。
[0073] [17]
[0074] -种细小病毒溶液，其是通过细胞培养而得到的，其包含IO8TCID5ciAiL以上的感染 滴度的细小病毒并且前述细小病毒的感染滴度（TCID5cZmL)与杂质蛋白质浓度（ng/mL)的 比为 10 :1 ~5000 :1。
[0075] 发明的效果
[0076] 根据本发明，可以利用细胞培养简便且有效率地得到IO8TCID5ciAiL以上的高感染 滴度的细小病毒溶液，能够消除起因于细小病毒使用时的感染滴度不足的障碍。
【具体实施方式】
[0077] 以下，对于用于实施本发明的方式（以下，称为"本实施方式"），更详细地进行说 明。需要说明的是，本发明不限定于以下的实施方式，可以在其要旨的范围内进行各种变形 而实施。
[0078] 本实施方式为一种高感染滴度的细小病毒的生产方法，其为通过在培养基材中培 养宿主细胞和细小病毒的种病毒，从而在培养上清中生产IO 8TCID5cZmL以上的高感染滴度 的细小病毒的方法，其包括：
[0079] 工序（a)，事先分别算出前述培养中的宿主细胞的对数增殖期的倍增时间和汇合 增殖时的宿主细胞的细胞密度；
[0080] 工序（b)，向包含宿主细胞和培养基的前述培养基材以感染复数（MOI)成为 0. 0001~0. 1的方式接种细小病毒的种病毒，所述宿主细胞的细胞密度为工序（a)中事先 算出的汇合增殖时的宿主细胞的细胞密度的1/500~1/20 ;
[0081] 工序（c)，对于工序（b)的包含宿主细胞和细小病毒的培养物以工序（a)中事先算 出的倍增时间的5~11倍的时间进行培养；和
[0082] 工序（d)，对于包含通过工序（c)的培养而得到的细小病毒的培养上清进行回收。
[0083] 工序（a):首先，事先分别算出细小病毒宿主细胞的对数增殖期的倍增时间和汇 合增殖时的宿主细胞的细胞密度。需要说明的是，宿主细胞可以通过传代培养而增殖。
[0084] 细小病毒为小型的线状单链DNA病毒。DNA病毒是具有DNA作为基因组的病毒，利 用宿主细胞的RNA聚合酶由基因组DNA合成mRNA，以该mRNA为基础合成蛋白质进行增殖。 DNA病毒的大部分为双链DNA病毒，细小病毒具有线状单链DNA作为基因组。在单链DNA的 状态下不能进行病毒增殖，所以细小病毒具有以下特有的增殖机理：在宿主细胞的RNA聚 合酶的基础上，还利用DNA聚合酶经过双链DNA的状态进行增殖。
[0085] 细小病毒科（Parvoviridae)病毒已知有：属于细小病毒亚科的3个属，即，病 毒复制中不需要辅助病毒而在宿主细胞内自律地增殖的细小病毒属（Parvorivirus)、 需要辅助病毒的依赖病毒属（Dependovirus)以及特异性地感染红血球的红病毒属 (Erythrovirus);和属于浓核病毒亚科的3个属：感染昆虫的浓核病毒属（Densovirus)Jg 同病毒属（Iteravirus)和埃及伊蚊浓核病毒属（Aedes aegypti densovirus)。本实施方 式中的"细小病毒"是指细小病毒属的病毒。细小病毒属的病毒具有相似的增殖机理，所以 可以与本实施方式的方法共通而利用。
[0086] 对于本实施方式中的细小病毒（细小病毒属病毒），没有限定，包括：猪细小病 毒（Por