负载条件是pH 6. 5至7. 5和彡5-20 mS/cm的电导率；阴 离子交换膜是耐盐阴离子交换膜；阴离子交换膜负载率为约200毫克载脂蛋白/每mL膜； 且所述载脂蛋白是人或狒狒ApoLl或人Ap 〇L2。
[0022] 本发明还提供了对于载脂蛋白去除内毒素的方法，其包括：通过向从阴离子交换 膜收集的含有载脂蛋白的合并物添加盐酸胍、尿素和硫酸铵的任何组合而解折叠所述载脂 蛋白；将所述载脂蛋白以流通模式负载至疏水相互作用层析（HIC)柱上；用适当的洗涤缓 冲液洗涤所述HIC柱；和收集流通液。在其它实施方案中，将含有载脂蛋白的合并物在以下 条件下负载至HIC柱上：pH 6.0 - 7.5 ;b) 130 - 170 mS/cm的电导率；2至6M盐酸胍； 以0. 5至3克载脂蛋白/每升树脂负载所述载脂蛋白；0至0. 7M硫酸铵；和0至2. 5M尿素。
[0023] 在又进一步实施方案中，所述疏水相互作用层析洗涤缓冲液是20 mM磷酸钠，6M 盐酸胍，0. 75M硫酸铵，pH 7 ;且所述载脂蛋白是人或狒狒ApoLl或人Ap〇L2。
[0024] 详述 如本文（包括随附权利要求）所使用，词语的单数形式诸如"一（a) "、"一（an)"和"该 (the) "包括其对应的复数对象，除非上下文另有清楚指出。
[0025] 如本文所使用，" ApoLl"是指载脂蛋白1，并且包括野生型人同种型EIK和KIK以 及变体G1和G2。ApoLl也可以指遗传修饰的野生型或变体蛋白，其中缺失N端甲硫氨酸或 丙氨酸。还包括修饰或未修饰的ApoLl的非人灵长类形式。
[0026] 如本文所使用，与pH或pi (等电点）值使用的术语"约"或"近似"是指0. 1至0. 5 个单位的方差。当与温度值使用时，"约"或"近似"是指1至5度的方差。当与其它值诸如 长度、重量或浓度使用时，"约"或"近似"是指1至10%的方差。
[0027] 如本文所使用，"混合物"包含目的载脂蛋白（对于其期望纯化）和一种或多种污 染物，即，杂质。已经"部分纯化"的混合物已经经受层析步骤，例如，疏水相互作用层析、离 子交换层析等。
[0028] 术语"层析"是指将目的分析物（例如，载脂蛋白）与存在于混合物中的其它分子 分离的任何种类的技术。
[0029] 术语"层析树脂"或"层析介质"在本文中可互换使用，并且是指任何类型的固相， 其将目的分析物与存在于混合物中的其它分子分离。通常，目的分析物与其它分子的分离 是作为混合物的个体分子在移动相的影响下移动通过静止固相的速率中的差异，或在结合 和洗脱过程中的差异的结果。非限制性实例包括阴离子交换树脂、阴离子交换膜和疏水相 互作用树脂。树脂的体积、待使用的柱子的长度和直径，以及动态容量和流速取决于几个参 数，诸如待处理的流体的体积，待进行本发明方法的流体中蛋白的浓度等。用于每个步骤的 这些参数的确定完全在本领域技术人员的平均技能内。
[0030] 术语"宿主细胞蛋白"是指在宿主细胞的裂解物中发现的除了目标蛋白以外的蛋 白。蛋白混合物中宿主细胞蛋白的量表示为相对于混合物中的目的蛋白的量的百万分率。
[0031] 如在本文可互换使用的术语"目标蛋白"和"目的蛋白"是指蛋白或多肽，包括但 不限于，待通过本发明的方法从蛋白混合物和任选地其它材料诸如宿主细胞蛋白、DNA、内 毒素等纯化的重组载脂蛋白。
[0032] 如本文所使用，术语"离子交换"和"离子交换膜层析"用来指这样的层析方法，其 中在混合物中的目的溶质或分析物与连接（诸如通过共价连接）到膜的带电荷的化合物相 互作用，使得目的溶质或分析物与带电荷的化合物非特异性相互作用多于或少于混合物中 的溶质杂质或污染物。在混合物中的污染性溶质比目的溶质更快或更慢地从离子交换材料 的膜上洗脱，或相对目的溶质结合树脂或从树脂排除。
[0033] 如本文所使用，术语"疏水相互作用层析"用来指这样的层析方法，其中在高盐浓 度下，蛋白的表面上的非极性基团与连接至固相层析介质的疏水性化合物相互作用。具有 较低盐浓度的洗脱缓冲液用于基于它们的疏水性与蛋白和污染物分离，其中较高疏水性蛋 白在层析梯度中较晚洗脱。
[0034] 分子与层析树脂的"结合"意指在适当的条件（pH和电导率）下将分子暴露于层 析树脂，使得分子借助配体-蛋白相互作用可逆地固定于层析树脂中或层析树脂上。非限 制性实例包括分子和树脂上的疏水性配体之间的疏水相互作用。
[0035] 在本文可互换使用的术语"流通"和"流通模式"是指这样的产物分离技术，其中 意欲使连同一种或多种污染物一起包含在样品中的至少一种产物（载脂蛋白）流通层析树 脂或介质，而至少一种潜在的污染物或杂质结合至层析树脂或介质。"流通模式"通常是等 度操作（即期间流动相的组成没有变化的层析方法）。
[0036] 如本文所使用，术语"洗脱"是指这样的方法，其中通过改变溶液条件，使得缓冲液 与目的分子竞争层析树脂上的配体位点而从层析树脂去除目的蛋白。
[0037] 术语"结合和洗脱模式"是指这样的产物分离技术，其中样品中包含的至少一个产 物结合至层析树脂或介质，并随后被洗脱。
[0038] 如本文可互换使用的术语"污染物"和"杂质"是指含有目标载脂蛋白的样品中的 任何外来或不适宜的分子，包括生物大分子诸如DNA、一种或多种宿主细胞蛋白、内毒素或 脂质，其中正使用本发明的方法将所述目的载脂蛋白与一种或多种外来或不适宜的分子分 离。另外，此类污染物可以包括在纯化方法之前出现的步骤中使用的任何试剂。
[0039] 蛋白的"等电点"或"pi"是指蛋白具有等于零的净总体电荷的pH，即蛋白具有相 等数目的正和负电荷的pH。
[0040] 如本文所使用，术语"缓冲液"是指通过其酸碱缀合组分的作用抵抗pH的变化的 溶液。
[0041] 如本文所使用，术语"洗涤缓冲液"是指用于在洗脱目的蛋白之前洗涤或平衡层析 树脂的缓冲液。
[0042] "洗脱缓冲液"用于将目标蛋白从固相洗脱。洗脱缓冲液的电导率和/或pH通常 是使得目标蛋白从层析树脂洗脱的电导率和/或pH。术语"等度洗脱"用来指其中流动相 的组成在整个洗脱过程期间没有改变的洗脱条件。术语"梯度洗脱"用来指流动相的组成 在整个洗脱过程期间变化的洗脱条件。
[0043] 本发明的其它特征和优点从本文所提供的包括不同实施例的附加描述中显而易 见。所提供的实施例说明可用于实施本发明的不同的组分和方法。所述实施例不限制所请 求保护的发明。基于本公开，技术人员可以鉴定并采用可用于实施本发明的其它组分和方 法。
[0044] 本文引用的所有参考文献都通过引用并入，其程度如同每个单独出版物、专利申 请或专利被具体且单独地指明通过引用并入。
[0045] 通用 本发明提供了在层析柱上重折叠和纯化脂蛋白的方法。具体而言，提供了使用疏水相 互作用柱（HIC)重折叠ApoLl多肽的方法。
[0046] ApoLl具有近似41 kDa的分子量和5. 49的理论等电点。Apo-Ll含有三个主要结 构域：大肠杆菌素孔形成结构域、膜寻址结构域和SRA-相互作用结构域。人ApoLl野生型同 种型￡11(和1(11(以及变体61和62("]\^"）的序列是5￡0 10勵：1、3、5和7。此外，4口〇11 同种型和变体（"Ala"）的工程改造形式也以SEQ ID N0 2、4、6和8提供。狒狒ApoLl (Met 和 Ala)是 SEQ ID N0:9-10。相关的载脂蛋白，ApoL2 是 SEQ ID N0:11。
[0047] 大肠杆菌素孔形成结构域显著增强Apo-Ll的细胞毒性，因为大肠杆菌素具有破 裂细胞质膜的能力。然而，这种增强的细胞毒性使得在大肠杆菌中生产Apo-Ll极端具有挑 战性，因为从Apo-Ll破坏膜完整性。
[0048] 几种方法，包括稀释、透析、渗滤、凝胶过滤和固定至固体载体上，可以用于去除或 减少过量变性剂和还原剂，允许蛋白复性。将变性溶液直接稀释至复性缓冲液中是最容易 的方法，但在重折叠后需要额外的纯化。在透析中，将变性蛋白溶液针对复性缓冲液透析， 但缺乏再现性和可扩