脂蛋白的柱上重折叠和纯化的制作方法
【专利说明】脂蛋白的柱上重折叠和纯化 发明领域
[0001] 本发明提供了用于纯化人脂蛋白诸如ApoLl的活性形式的方法。更具体地，本发 明涉及用于使用疏水相互作用柱将大肠杆菌中大量表达的蛋白的包涵体复性成活性形式 和去除杂质（例如，内毒素）的方法。
[0002] 发明背景 重组治疗蛋白的制造提出了许多纯化挑战，包括去除过程和产物相关的杂质，诸如内 毒素，宿主细胞蛋白和蛋白片段。这些挑战用载脂蛋白的生产扩增，因为这些疏水性蛋白倾 向于对杂质具有高结合亲和力，并且将共纯化，使得分离困难（参见，例如Caparon，等人 (2010) 乂 105:239 - 249)。载脂蛋白与杂质的相互作用增加了纯化 过程的复杂性，并且可以引发显著的产率损失，导致低生产量，高成本制造过程（参见，例 如 Hunter,等人（2009) /Progress 25(2) : 446-453)。
[0003] 人载脂蛋白LI (h-Ap〇Ll)是高密度脂蛋白（HDL)颗粒的次要蛋白组分，并且据 信在脂质转运和代谢中发挥作用（参见，例如，Duchateau，等人（1997) J沒iW.泛￡?. 272:25576 - 25582)。目前研宄已经显示h-Ap〇Ll的变体和非糖尿病慢性肾病的发病机理 之间的联系（参见，例如，Genovese,等人（2010) 329:841-845)。携带被称为G1 和G2的两种ApoLl风险等位基因的非裔美国人具有肾小球疾病的大大增加的风险。G1变 体具有两个错义突变（S342G和I384M)，而G2变体具有6个碱基对（bp)框内缺失，导致2 个氨基酸的缺失（N388del :Y389del)。在携带一个或两个风险等位基因的群体中，局灶性节 段性肾小球硬化症（FSGS)发生较早，并且更迅速地进展至终末期肾病（ESRD)(参见，例如， Kopp 等人（2011) 7；办?. 5bc. 22:2129-2137)。
[0004] 载脂蛋白LI (ApoLl)是h-Ap〇Ll和其相关变体（例如，EG、Gl、G2)的遗传修饰的 形式。ApoLl纯化制剂的生物活性使用基于细胞的布氏锥虫（rrjpafliosoffia fo-ycei)评价， 因为ApoLl的大肠杆菌素孔形成结构域将提高氯离子流入细胞膜并引起细胞死亡（参见， 例如 Perez-Morga 等人（2005) Science 309 (5733): 469 - 472)〇
[0005] ApoLl和h-AP0Ll两者都具有多个两亲性a螺旋，这导致可逆自结合现象和在溶 液中形成胶束结构，这与文献中先前描述的其它载脂蛋白的行为类似（参见例如Zehender 等人（2012) SiocAewistry 51:1269 - 1280 和 Calabresi 等人（1994) J 269:32168 - 32174)。呈其主要形式的ApoLl作为结合在一起的近似彡15个蛋白分子存 在。ApoLl单体由372个氨基酸组成，具有近似41 kDa的分子量和约5. 49的理论等电点 (pi)。狒狒ApoLl和人Ap〇L2在溶液中也作为多聚蛋白分子存在，分别具有40 kDa和37 kDa的近似分子量和约6. 52和6. 31的理论pi。
[0006] 对于多种蛋白，包括组氨酸标签的蛋白和重组蛋白，文献中已经描述了通过负载 解折叠蛋白和降低变性剂浓度而层析重折叠蛋白（参见，例如Zhu，等人.（2005) 37 (4): 265 - 269，例如 Cabanne,等人?（2005) J 汉818:23 - 27)。大多数这些蛋白含有半胱氨酸键，这需要被重折叠以便 在蛋白结构内形成正确的二硫键。然而，载脂蛋白由多个两亲性a螺旋组成，其通常在纯 化后重折叠。
[0007] 纯化载脂蛋白的先前方法由以下组成：使用高尿素浓度使蛋白自我结合最小化 以去除过程杂质，且经常涉及多个步骤（例如Hunter,等人（2008) A 1204:42 - 47和Bankston,等人（2010)沿'otecA 7； 5:1028-1039)。纯化ApoLl 的当前 方法涉及使用蛋白的N端组氨酸标签形式组合固定的金属离子亲和层析（IMAC)，以提高蛋 白纯度。结合至蛋白的组氨酸标签能够实现替代纯化方案，但可导致免疫原性。由于ApoLl 蛋白在高尿素浓度下不显著解离，所以需要不同方法用于去除过程相关的杂质。当前方法 涉及基于其扩增赋形剂与ApoLl的相互作用的能力选择赋形剂（即，洗涤剂和变性剂组合） 和层析树脂和膜，用于基于蛋白的折叠状态选定清除过程杂质。本发明通过提供纯化高度 自我结合载脂蛋白的方法来填补该未满足的需求。
[0008] 附图描述 以下附图形成本说明书的部分，并且被包括以进一步说明本公开的某些方面。本公开 可以通过参考这些附图中的一个或多个组合本文呈现的具体实施方案的详细描述而更好 地理解。
[0009] 图1是ApoLl EIK和KIK同种型的比较。
[0010] 图2A-2C是EIK WT、G1和G2 (HIC进料和洗脱液）分别的RP-HPLC概况。
[0011] 图3是AP0L1 WT在各种缓冲液基质中的圆二色谱概况。缓冲条件如下代表：3M盐 酸胍，空心三角（厶），8M尿素，2 w/v% SDS，空心正方形（口）和HIC洗脱液，空心圆（〇 )〇
[0012] 图4A-4B是AP0L2 HIC和ApoL2狒狒进料和洗脱液的RP-HPLC概况。
[0013] 图5是AP0L1野生型、AP0L2和AP0L1狒狒的还原SDS-Page凝胶。
[0014] 图6A-6B是ApoLl狒狒和ApoL2的圆二色谱概况。
[0015] 图7A-7B是ApoLl狒狒和ApoL2的色氨酸荧光概况。
[0016] 图8是载脂蛋白层析纯化方法的示意图。
[0017] 图9是AP0L1野生型和AP0L1狒狒的生物活性概况。
[0018] 发明概述 本发明基于脂蛋白可以使用专门的层析步骤重折叠和纯化的发现。本发明提供了重折 叠和纯化细菌细胞中表达的脂蛋白的方法，其包括：在增溶缓冲液中增溶和解折叠包涵体； 将含有脂蛋白的缓冲液的电导率调节至至少65 -130 mS/cm;将含有所述脂蛋白的缓冲液 负载在疏水相互作用层析（HIC)柱上；用洗涤缓冲液洗涤HIC柱；和用梯度洗脱缓冲液或 非梯度洗脱缓冲液洗脱所述脂蛋白，从而产生具有至少44%的纯度的HIC柱洗脱液，如通 过反相高效液相层析（RP-HPLC)所测定。在某些中，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞；并且所 述增溶缓冲液包含2% SDS、100mM Tris、100mM NaCl、200mM精氨酸和8M尿素，pH 7至10。 在进一步实施方案中，将所述脂蛋白在所述增溶缓冲液中在15-30°C孵育一至二十四小时。 在进一步实施方案中，对于含有半胱氨酸残基的载脂蛋白，将二硫苏糖醇（lmM)添加至解 折叠缓冲液中。
[0019] 本发明还涵盖，用20 mM磷酸钠和1至2M硫酸铵将含有所述脂蛋白的缓冲液的电 导率调节至65 -100 mS/cm。在进一步实施方案中，所述HIC柱负载有高达15克载脂蛋白 /每升HIC树脂；所述洗涤缓冲液包含1 M硫酸铵，pH 7,并且所述梯度洗脱缓冲液包含约 20 mM磷酸钠和1 M硫酸铵，pH7(缓冲液A)至约20 mM磷酸钠，pH 7(缓冲液B)的梯度，并 且所述脂蛋白经20个柱体积洗脱。在其它实施方案中，缓冲液A包含20 mM磷酸钠和0.2 至0. 3 M硫酸铵，pH 7,并且缓冲液B包含20 mM磷酸钠，pH 7,尿素浓度为0至8M。在其 它实施方案中，缓冲液A和缓冲液B都由0至8M尿素构成。
[0020] 本发明进一步提供了纯化载脂蛋白的方法，其包括：以流通模式将含有载脂蛋白 的HIC柱洗脱液负载至耐盐阴离子交换层析膜上，进料条件为pH 6.5 - 8.0,电导率为 彡5至30 mS/cm，且膜负载率为至少50毫克载脂蛋白/每mL膜；用pH 6. 5-8. 0的20mm HEPES和200mM NaCl洗涤所述膜；和收集流通液。
[0021] 在又进一步实施方案中，