牛流感病毒组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物学和免疫学领域，特别涉及病毒和包含其的免疫原性组合物。 具体地，它涉及从牛中分离的C型流感病毒。本文还公开了C型流感病毒多核苷酸和多肽。 最后，本发明公开了诊断试剂盒和检测方法。
【背景技术】
[0002] 牛呼吸道疾病（BRD)复合物是肉牛工业最显著的健康问题。在1991年，由于治疗 成本、生产损失和死亡，发生估计$624, 000, 000的损失。BRD复合物是多因素感染，具有许 多促成病原体，为病毒和细菌两种。
[0003] 含有负义基因组的有包膜单链RNA的病毒科分类为具有不分段基因组的组（副粘 液病毒科、弹状病毒科）或具有分段基因组的组（正粘病毒科、布尼亚病毒科和沙粒病毒 科）。正粘病毒科仅含有流感病毒，为A、B和C型。
[0004] 流感病毒颗粒由含有分段单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心（螺旋核衣壳） 和内部由基质蛋白（M)衬里的外部脂蛋白包膜组成。A型流感的分段基因组由线性、负极 性、单链RNA的八个分子（C型流感为七个）组成，所述单链RNA编码十种多肽，包括：RNA指 导的RNA聚合酶蛋白质（PB2、PB1和PA)和形成核衣壳的核蛋白（NP);基质蛋白（M1、M2); 从脂蛋白包膜伸出的两种表面糖蛋白：血凝素（HA)和神经氨酸苷酶（NA)(这是C型流感病 毒缺乏的）；以及其功能未知的非结构蛋白质（NS1和NS2)。基因组的转录和复制在核中发 生，并且装配经由在质膜上出芽而发生。病毒可在混合感染期间重配基因。
[0005]C型流感病毒在该属中仅具有被称为"C型流感病毒"的一个物种。C型流感病毒 已从人和猪中分离出。A和B型流感病毒为通常被称为"流行性感冒"的感染的成因剂，所 述流行性感冒可产生寒战、发热、咽喉痛、肌肉痛、头痛、咳嗽、虚弱/疲乏和全身不适的临 床症状。然而，与A或B型相比较，C型流感病毒是罕见的，并且在人中引起轻度上呼吸道 感染或感染是不明显的。
【发明内容】
[0006] 本申请人已惊讶地鉴定并且在本文中公开了从牛中分离的C型流感病毒。本文公 开且提供了所述牛C型流感病毒的多核苷酸和多肽，以及含有所述多核苷酸和或所述多肽 的免疫原性组合物。本发明还提供了检测牛C型流感病毒的诊断试剂盒和方法。
[0007] 在一个实施例中，本公开提供了分离的牛C型流感病毒。
[0008] 在另一个方面，本发明提供了包含分离的C型流感病毒的组合物，其中所述病毒 包含下述基因区段中的至少一种：编码与SEQIDN0 :4具有大于52%同一性的蛋白质的核 酸；编码与SEQIDN0 :6具有大于72%同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQIDN0 :8具有 大于50%同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQIDN0 :10具有大于54%同一性的蛋白质的 核酸；编码与SEQIDN0:12具有大于40%同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQIDN0:14 具有大于36%同一性的蛋白质的核酸；和编码与SEQIDNO: 16具有大于33%同一性的蛋 白质的核酸。
[0009] 在另一个方面，本发明提供了包含分离的核酸的组合物，其中所述分离的核酸包 含下述核酸中的一种或多种：编码与SEQIDN0 :4具有大于52%同一性的蛋白质的核酸； 编码与SEQIDN0 :6具有大于72%同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQIDN0 :8具有大于 50%同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQIDN0 :10具有大于54%同一性的蛋白质的核酸； 编码与SEQIDN0:12具有大于40%同一性的蛋白质的核酸；编码与SEQIDN0:14具有大 于36%同一性的蛋白质的核酸；和编码与SEQIDNO: 16具有大于33%同一性的蛋白质的 核酸，其中SEQIDN0:4编码C型流感"PB2"蛋白质；SEQIDN0:6编码C型流感"PB1"蛋 白质；SEQIDN0:8编码流感"PA"蛋白质；SEQID勵：10编码(：型流感"册"蛋白质；5￡0 IDN0:12编码C型流感"N"蛋白质；SEQIDN0:14编码C型流感"M"蛋白质；而SEQID NO:16编码C型流感"NS1"蛋白质。
[0010] 在另外的方面，本发明提供了包含牛C型流感病毒的免疫原性组合物、表达载体 和宿主细胞，和/或根据本发明的先前提及方面的氨基酸和/或核酸。
[0011] 在另外一个方面，本发明提供了治疗由C型流感病毒引起的疾病或使动物免于由 C型流感病毒引起的疾病的方法，该方法包括给动物施用包含该病毒的免疫原性组合物，或 根据上文公开的本发明方面的一种或多种核酸序列或者一种或多种氨基酸序列。
[0012] 在其他方面，本发明提供了诊断试剂盒和方法，以及可用于此类方法和试剂盒的 抗体和/或核苷酸引物。更具体而言，在一些方面，本发明提供了检测动物对C型流感病毒 的暴露的方法，所述方法包括测定来自动物的样品中SEQIDN0 :3 ;5 ;7 ;9 ;11 ;13 ;和15中 任何一种或多种的存在。
[0013] 在另一个方面，本发明提供了检测动物对C型流感病毒的暴露的方法，所述方法 包括测定来自动物的样品中SEQID勵：4;6;8;10;12;14;和16中任何一种或多种的存 在。
[0014] 在另外一个方面，本发明提供了与分离的牛C型流感病毒特异性结合的抗体。
[0015] 在另一个方面，本发明还提供了与来自多肽的表位特异性结合的抗体，所述多肽 选自SEQIDN0 :4 ;6 ;8 ;10 ;12 ;14 ;和 16-20 的多肽。
【附图说明】
[0016] 图1是分离的牛C型流感病毒的电子显微照片。
【具体实施方式】
[0017] 本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其他参考文献均以引用方式全文并入。
[0018] 下述定义可应用于实施例的说明中采用的术语。下述定义替代以引用方式并入本 文的每个个别参考文献中含有的任何矛盾定义。
[0019] 除非本文另有定义，否则与本实施例结合使用的科学和技术术语应具有本领域普 通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，而复 数术语应包括单数。
[0020] 如本文使用的，当与可测量的数字变量结合使用时，术语"约"或"大约"意指所示 的变量值，以及在所示值的实验误差内的所有变量值（例如在平均值的95%置信区间内）， 或在所示值的10%内，无论哪个值更大。
[0021] 如本文使用的，术语"佐剂"意指修改其他试剂例如药物或免疫原性组合物的效应 的药理学或免疫学试剂。佐剂通常包括在免疫原性组合物中，以增强接受者对所供应抗原 的免疫应答。关于佐剂的更多描述参见下文。如本文使用的，术语"氨基酸"指天然存在和 合成氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟 物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及以后修饰的那些氨基酸，例如 羟脯氨酸、羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。二十种常规氨基酸的立体异构体（例如D-氨基 酸），非天然氨基酸例如a和a二取代氨基酸、N-烷基氨基酸及其他非常规氨基酸，也可 为本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的例子包括：4_羟脯氨酸、y-羧基谷氨酸、e-N， N，N_三甲基赖氨酸、e-N-乙基赖氨酸、0-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、 3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、〇 -N-甲基精氨酸及其他类似氨基酸和亚氨基酸。
[0022] 氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，所述基 本化学结构即与氢结合的碳、羧基、氨基和R基。示例性氨基酸类似物包括例如高丝氨酸、 正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基（例如正亮氨 酸）或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的必需化学结构。氨基酸模拟物 指如下化学化合物，其具有的结构不同于氨基酸的一般化学结构，但以类似于天然存在的 氨基酸的方式起作用。
[0023] 氨基酸在本文中可通过其由IUPAC-IUB生物化学命名委员会（Biochemical NomenclatureCommission)推荐的通常已知的三字母符号或其单字母符号提及。
[0024] 如本文使用的，术语"保守氨基酸置换"指关于给定氨基酸残基的任何氨基酸置 换，其中置换残基在化学上如此类似于给定残基，使得不产生多肽功能的实质降低（例 如酶促活性）。保守氨基酸置换是本领域通常已知的，并且其例子例如在美国专利号 6, 790, 639、6, 774, 107、6, 194, 167或5, 350, 576中描述。在优选实施例中，保守氨基酸置换 将是在下述六组之一中发生的任何一种置换：
[0025] ?小的脂肪族、基本上非极性残基：Ala、Gly、Pro、Ser和Thr;
[0026] ?大的脂肪族、非极性残基：Ile、Leu、Val和Met;
[0027] ?极性、带负电的残基：Asp和Glu;
[0028] ?极性、带负电的残基的酰胺：Asn和Gin;
[0029] ?极性、带正电的残基：Arg、Lys和His;以及
[0030] ?大的芳香族残基：Trp、Tyr和Phe。
[0031] 在优选实施例中，保守氨基酸置换将是作为天然残基（保守置换）对列出的下 述中的任何一种：Ala(Ser);Arg(Lys);Asn(Gin;His);Asp(Glu);Gln(Asn);Glu(Asp); Gly(Pro) ；His(Asn；Gln) ；Ile(Leu；Val) ；Leu(lie；Val) ；Lys(Arg；Gln；Glu) ；Met(Leu； lie)；Phe(Met；Leu；Tyr) ；Ser(Thr) ；Thr(Ser) ；Trp(Tyr) ；Tyr(Trp；Phe)；和Val(Ile; Leu) 〇
[0032] 如本文使用的，术语"动物"意指对被牛C型流感病毒感染敏感的驯养和野生的任 何动物，包括哺乳动物。优选地，如本文使用的，"动物"指牛。
[0033] 如本文使用的，术语"抗体"意指借助于表位的识别能够与抗原结合的免疫球蛋白 分子。免疫球蛋白是由"轻"和"重"多肽链组成的血清蛋白质，其具有"恒定区"和"可变 区"，并且基于恒定区的组成分类（例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。对于给定抗原"特异 性"的抗体指示抗体的可变区专一地识别且结合特定抗原。抗体可为多克隆混合物，或为单 克隆的。它们可为源自天然或重组来源的完整免疫球蛋白，或可为完整免疫球蛋白的免疫 反应部分。抗体可以多种形式存在，包括？ ￥4&13'、？(&13'）2、？(3，以及单链。抗体可转换为 抗原结合蛋白质，所述抗原结合蛋白质包括但不限于抗体片段。如本文使用的，可互换使用 的术语"抗原结合蛋白质"、"抗体"等等指包含抗原结合位点的一种或多种多肽或其片段。 术语"抗原结合蛋白质"或"抗体"优选指单克隆抗体及其片段，以及其可与特定蛋白质及其 片段结合的免疫学结合等价物。如本文使用的，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗 体，还涵盖其片段。为了本发明的目的，"抗体"和"抗原结合蛋白质"还包括抗体片段，除非 另有说明。示例性抗体片段包括？813、？313'、？(313')2、？￥、8〇?￥、？(1、(^13、双抗体、其抗原 识别片段、小分子免疫药物（SMIP)纳米抗体、IgNAR(免疫球蛋白新抗原受体）分子等等， 均由本领域技术人员识别为抗原结合蛋白质或抗体片段，以及上述片段及其化学或遗传处 理的配对物中任一种，以及其他抗体片段及其突变体，包含抗体部分的融合蛋白，以及包含 抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰的构造。抗体和抗原结合蛋白质可例如 经由下述进行制备：常规杂交瘤技术（Kohler等人，Nature256 :495-499(1975))、重组DNA 方法（美国专利号4, 816, 567)或使用抗体文库的菌体展示技术（Clackson等人，Nature 352 :624-628 (1991);Marks等人，J.Mol.Biol. 222 :581-597 (1991))。对于多种其他抗体生 产技术，参见Antibodies:ALaboratoryManual，Harlow等人编辑，ColdSpringHarbor Laboratory，1988以及本领域技术人员众所周知的其他技术。<