白蛋白结合多肽的制作方法
【专利说明】白蛋白结合多肽 发明领域
[0001] 本发明涉及结合白蛋白结合结构域ABD的多肽。该多肽具有多种工业和药物应 用，例如在分离技术中用作亲和配体或在分子诊断学中用作检测剂。
[0002] 置量
[0003] 血清白蛋白是在哺乳动物血清中最丰富的蛋白（在人中35_50g/l， 即 0.53-0.75mM)，且例如在W091/01743、W001/45746 和Dennis等（JBiolChem 277:35035-43、2002)中已经描述了将肽或蛋白共价偶联到将允许体内连接到血清白蛋 白的载体分子上的若干策略。W091/01743特别地（interalia)描述了源自链球菌蛋白 G(SpG)的白蛋白结合肽或蛋白用于增加其他蛋白的半衰期的用途。该观念是将源自细菌的 白蛋白结合肽/蛋白融合到治疗目的的肽/蛋白，所述治疗目的的肽/蛋白已经显示出具 有从血液中的快速消除。在体内，产生的融合蛋白与血清白蛋白结合，且受益于其更长半衰 期，这增加了融合的治疗目的的肽/蛋白的净半衰期。血清白蛋白的半衰期与动物的大小 直接成比例，其中例如人血清白蛋白（HSA)具有19天的半衰期且兔血清白蛋白具有约5天 的半衰期（McCurdy等，JLabClinMedl43:115,2004)。
[0004] 链球菌蛋白G(SpG)是存在于链球菌（str印tococci)某些菌株的表面上的双功 能受体，并能够结合IgG和血清白蛋白两者（.Bj6rck.等，MolImmunol24:1113,1987)。 该结构为高度重复的，具有若干结构上和功能上不同的结构域（Guss等，EMB0J 5:1567, 1986)，更准确地说三个Ig结合结构域和三个血清白蛋白结合结构域（Olsson 等，EurJBiochem168:319,1987)。已经确定了SpG中的三个血清白蛋白结合结构域之 一的结构，显示为三螺旋束折叠（Kraulis等，FEBSLett378:190, 1996,Johansson等，工 Biol.Chem. 277:8114-20, 2002)。46个氨基酸的基序被定义为ABD(白蛋白结合域，albumin bindingdomain)并且随后还已被命名为G148-GA3(GA代表蛋白G相关的白蛋白结合 (proteinG-relatedalbuminbinding)且G148 来自其源自的链球菌菌株）。
[0005] 开发了具有极大改善对人血清白蛋白的亲和性的GA3-G148的人工变体（Jonsson 等，ProtEngDesSel21:515-27,2008;W02009/016043)、以及具有减少的免疫刺激性质 的工程化高亲和性变体（W02012/004384)。后者受在GA3-G148内实验性地鉴定了数个T细 胞和B细胞表位的事实的启发（Goetsch等，ClinDiagnLabImmunol10:125-32, 2003), 使得此结构域本身较不适合用在用于人类施用的药物组合物中。遍及当前文本中，例如在 W02009/016043和W02012/004384中展示的GA3-G148及其各种工程化衍生物共同地被称为 "ABD"。因此，在本公开内容中"ABD"表示此类白蛋白结合多肽，而不是具有特定氨基酸序 列的特定多肽。
[0006] 随着将白蛋白结合结构域掺入治疗或诊断组合物中兴趣的增加，带来了对用于分 离共价连接到ABD的分子的廉价和高效纯化策略的增长的需求，所述共价连接到ABD的分 子例如通过在原核或真核系统中重组表达或通过直接化学共轭连接到ABD来产生。用于纯 化重组表达蛋白的一般策略将包括通常使用的亲和标签诸如聚组氨酸标签、几丁质结合蛋 白（CBP)、麦芽糖结合蛋白（MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶（GST)标签或FLAG标签，并使用了 特别为每种标签开发的商业树脂进行经典亲和分离。然而，对于某些应用，且特别是对于将 作为治疗剂使用的分子，终产物必须为均质的。由于需要例如通过酶促或化学裂解去除标 签，必须确保完全裂解以获得均质产物，或当去除未完全裂解的产物时遭受收率的损失。此 类问题两者造成增加产物的生产成本。因此，更具启发性的策略将是利用ABD基序本身作 为纯化标签。此策略的一个实例为将重组白蛋白偶联到固体支持物（参见例如，Jonsson 等，ProtEngDesSel21:515-27,2008;Andersen等，JBiolChem286:5234-41,2011)。 从粗溶质中，包含ABD标签的化合物被白蛋白捕获，去除非特异性吸附的污染物且随后通 过干扰与白蛋白特异性但可逆的相互作用回收加ABD-标签的化合物。然而，白蛋白是对不 同蛋白、脂肪酸、固醇类、离子等具有若干相互位点的大天然载体分子，且因此特异性和非 特异性组分两者的背景结合可污染回收的样品。尽管事实上已经开发了重组人白蛋白，将 其包括作为治疗产品的大规模生产中的亲和配体还是昂贵的，特别是因为其与用于就地清 洗（cleaninginplace)的标准程序不相容，对于白蛋白偶联基质的重复使用将不得不应 用用于就地清洗的标准程序。此外，可需要更苛刻的洗脱条件以回收包含对白蛋白具有异 常高亲和性的ABD变体的分子。此类条件还可对于加ABD-标签的分子是不利的。
[0007] 由于蛋白A对IgG的Fc部分的天然亲和性，长期以来已经使用来自金黄色葡萄球 菌（Staphylococcusaureus)的蛋白A作为单克隆抗体和Fc融合蛋白的工业生产中的亲和 配体。因而，蛋白A以其整体，以及其单独的Fc结合结构域，已作为具有改善性质的工程化 亲和配体的合理设计的起点。对于介绍，参见由NordK和同事在ProtEng(Nord等，Prot Eng8:601-608;1995)和在NatBiotech(Nord等，NatBiotech15:772-777 ;1997)中的文 早。
[0008] 本公开内容的一个目的在于提供新的ABD结合剂。此外，本公开内容的一个目的 在于提供用于在生物技术例如在蛋白纯化和分离应用中使用的新ABD结合剂。
[0009] 发明描沐
[0010] 这些目标和从本公开内容对技术人员明显的其他目标可通过一种或更多种以下 公开的多个发明方面来实现。
[0011] 因此，在第一方面，本公开内容提供ABD结合多肽，包含ABD结合基序BM，该基序由 选自以下的氨基酸序列组成：
[0012] i)EX2X3X4AX6X7EIX10XnLPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28D
[0013] 其中，彼此独立地，
[0014] X2选自F、I和L;
[0015] X3选自H、K、N、Q、R、S、T*V;
[0016] 父4选自八、0、卩、6、11、1、1(、1、]\1、队〇、1?、5、1\￥、1和￥;
[0017] X6选自F、I、L和Y;
[0018] 父7选自八、11、1、1(、1、队〇、1?、5、1'和￥;
[0019] X1(l选自G、H、K、N、Q、R和S;
[0020] 父11选自六、0、卩、6、1、1(、1、队〇、1?、5、1\￥和￥;
[0021] X16选自N和T;
[0022] X17选自F、H、L、S和T;
[0023] X18选自D、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T和V;
[0024] X2Q选自H、K和R;
[0025] X21选自I、L和V;
[0026] X25选自F、I、L、V和Y;
[0027] X26选自K和S;
[0028] X28选自 D 和E;
[0029] 和
[0030] ii)与在i)中定义的序列具有至少89%同一性的氨基酸序列。
[0031] 与以上定义一类序列相关的ABD结合多肽是基于亲本支架的许多随机多肽变体 的统计学分析，所述多肽变体在若干不同选择实验中通过其与ABD的相互作用来选择。鉴 定的ABD结合基序，或"BM"相应于亲本支架的靶结合区域，所述区域构成在三螺旋束蛋白 结构域内的2个a螺旋。在亲本支架中，两个BM螺旋的变化的氨基酸残基组成用于与抗 体的恒定Fc部分的相互作用的结合表面。在本发明中，结合表面残基的随机变化和变体的 后续选择已经用与ABD相互作用的容量替换Fc相互作用容量。
[0032] 本文公开的ABD结合多肽表现一系列特性，例如当偶联到固体支持物时，使得其 适于作为用于纯化包含ABD的分子的亲和配体。例如，与使用人白蛋白作为亲和配体相比 较，公开的ABD结合多肽显示以下优势：
[0033] ?每毫升配体偶联基质的更高纯化能力。
[0034] ?与用于就地清洗的重复程序的相容性，例如使用0. 5M氢氧化钠，其使得ABD结合 多肽在大规模生产治疗产品中有用。
[0035] ?实现更温和洗脱条件，例如在更高pH下的洗脱，其使得纯化更宽范围的包含ABD 的不同分子成为可能。
[0036] 在纯化包含ABD的靶蛋白的上下文中，本公开内容的ABD结合多肽可在一个或更 多个不同纯化阶段中有用。因此，可在第一捕获步骤中、在任意中间纯化步骤或在最终精制 步骤中的一个或者更多个中使用所述ABD结合多肽而没有限制。
[0037] 技术人员将理解，使用包含根据本公开内容的ABD结合多肽的树脂可实现靶蛋白 的成功纯化，而无论ABD基序在靶蛋白中所处的位置。因此，可将ABD部分放置在靶蛋白的 N端或C端。可选地，靶蛋白可以为包含在其两侧侧面为其他蛋白部分的ABD部分的融合蛋 白。
[0038] 在本公开内容的上下文中，"ABD"是指来自链球菌蛋白G的三螺旋白蛋白结合结 构域及其衍生物。特别地，"ABD"可以指GA3-G148 (上述Johansson等，特此通过引用并入） 或对白蛋白具有增强亲和性的GA3-G148的变体（W02009/016043,特此通过引用并入）以及 具有减少的免疫刺激性质的高亲和性变体（W02012/004384)。换句话说，在本公开内容中， "ABD"表示在参考文献中所述的此类白蛋白结合多肽，而不是具有特定氨基酸序列的特定 多肽。
[0039] 如技术人员将认识到的，任何多肽的功能诸如本公开内容的多肽的ABD结合容量 取决于多肽的三级结构。因此，对多肽中的氨基酸序列做出较小改变而不影响其功能是可 能的。因此，本发明涵盖包含BM的修饰变体的多肽，所述BM的修饰变体使得产生的序列与 通过i)定义的序列至少89%相同。在本发明的一个实施方案中，所述BM的修饰变体使得 其与通过i)定义的序列至少93%相同。在又另一个实施方案中，所述BM变体与通过i)定 义的序列至少96%相同。
[0040] 在一些实施方案中，此类变化可在如本文公开的ABD结合多肽的序列的所有位置 中做出。在其他实施方案中，此类变化可仅在非可变位置中做出，所述非可变位置还被表示 为支架氨基酸残基。在此类情况下，不允许在可变位置，即在序列i)中用"X"表示的位置 中的改变。例如，属于氨基酸残基的某些功能分组（例如，疏水、亲水、极性等）的一个氨基 酸残基，可被来自相同功能组的另一个氨基酸残基交换是可能的。
[0041] 如遍及使用的术语"同一性％ "可如下计算。使用CLUSTALW算法（Thompson 等，NucleicAcidsResearch, 22:4673-4680 (1994))将查询序列与靶序列进行比对。在与 比对序列的最短序列相应的窗口上进行比较。在一些情况下，比对序列的最短序列可以是 靶序列。在其他情况下，查询序列可构成比对序列的最短序列。比较了每个位置上的氨基 酸残基，且将在查询序列中具有靶序列中的相同对应的位置的百分比报告为同一性％。
[0042] 在一个实施方案中，在序列i)中X2选自F和L。
[0043] 在一个实施方案中，在序列i)中&为F。
[0044] 在一个实施方案中，在序列i)中&为L。
[0045] 在一个实施方案中，在序列i)中X3选自H、K、R、T和V。
[0046] 在一个实施方案中，在序列i)中X3选自H、K、R和V。
[0047] 在一个实施方案中，在序列i)中X3选自H、K和V。
[0048] 在一个实施方案中，在序列i)中X3选自K和R。
[0049] 在一个实施方案中，在序列i)中&为K。
[0050] 在一个实施方案中，在序列i)中&为R。
[0051] 在一个实施方案中，在序列i)中X3sv。
[0052] 在一个实施方案中，在序列i)中X4选自A、H、I、L、N、V*W。
[0053] 在一个实施方案中，在序列i)中X4选自H、L、N和V。
[0054] 在一个实施方案中，在序列i)中\为V。
[0055] 在一个实施方案中，在序列i)中乂4为N。
[0056] 在一个实施方案中，在序列i)中\为H。
[0057] 在一个实施方案中，在序列i)中乂4为L。
[0058] 在一个实施方案中，在序列i)中X4选自A、L、N、V和W。
[0059] 在一个实施方案中，在序列i)中X4选自A、N、V和W。
[0060] 在一个实施方案中，在序列i)中X4选自A、N和W。
[0061] 在一个实施方案中，在序列i)中X6选自F和L。
[0062] 在一个实施方案中，在序列i)中X6为F。