。
[0192] 如以上所讨论的，与以上氨基酸序列相比包含较小改变而没有极大地影响三级结 构和其功能的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，如以上定义的ABD 结合多肽可例如具有与由v)、vii)或ix)定义的序列至少84%、至少86%、至少88%、至 少90%、至少92%、至少94%、至少96%、至少98%相同的序列。
[0193] 在一些实施方案中，ABD结合基序可形成包含选自以下的氨基酸序列的多肽的部 分：
[0194] ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK;
[0195] ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK;
[0196] ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK；
[0197] ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK;
[0198] AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK；
[0199] VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
[0200] AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK；
[0201] VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK;
[0202] VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK;
[0203] AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
[0204] VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK;
[0205] VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK;和
[0206] AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK。
[0207] 在一个实施方案中，ABD结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
[0208] xi)VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK；
[0209] 其中[BM]是如以上定义的ABD结合基序；和
[0210] xii)与由xi)定义的序列具有至少84%同一性的氨基酸序列。
[0211] 再次，与以上氨基酸序列相比包含较小改变而没有极大地影响三级结构和其功能 的多肽也在本公开内容的范围内。因此，在一些实施方案中，如以上定义的ABD结合多肽可 例如具有与由xi)定义的序列至少86%、至少87%、至少89%、至少91%、至少93%、至少 94%、至少96%、或至少98%相同的序列。
[0212] 在此多肽中的序列xi)可选自SEQIDN0:105-156中的任一个。特别地，序列xi) 可选自SEQIDN0:105-lll中的任一个，诸如选自SEQIDN0:105、SEQIDN0:106、SEQID NO: 107和SEQIDNO: 108。在此多肽的具体实施方案中，序列xi)为SEQIDNO: 105。
[0213] 本发明的多肽可以是单体或多聚体形式。在本发明的一个实施方案中，ABD结合 多肽以多聚体形式呈现，包含至少2个ABD结合多肽单体单元，其氨基酸序列可以是相同或 不同的。多肽的多聚体形式可以是有利的，因其可具有增强的结合性质。
[0214] 在一个实施方案中，所述ABD结合多肽单体单元共价偶联到一起。在特定实施方 案中，ABD结合多肽单体单元被表达作为融合蛋白。
[0215] 多肽可使用已知有机化学方法通过共价偶联来连接，或在用于多肽的重组表达的 系统中表达为一种或更多种融合多肽，或以任何其他方式、直接地或通过连接子例如氨基 酸连接子来连接。
[0216] 在一个实施方案中，所述ABD结合多肽为二聚形式。可能的多聚体形式还包括三 聚体形式。多肽的多聚体形式可包含如以上定义的适合数量的多肽序列。
[0217] 技术人员将理解，可对根据本文公开的任何方面的ABD结合多肽进行各种修饰和 /或添加，以对特定应用定制多肽而不偏离本公开内容的范围。例如，本文公开的任何ABD 结合多肽可包含另外的C末端和/或N末端氨基酸。此多肽应被理解为在多肽链的最前和 /或最末位置处，即在N末端和/或C末端具有添加的氨基酸残基的多肽。因此，ABD结合 多肽可包含任何适合数量的添加的氨基酸残基，例如至少一个添加的氨基酸残基。每个添 加的氨基酸残基可单独地或共同地添加，使得例如改善多肽的产生、纯化、在体内或在体外 稳定化、偶联或检测。此类添加的氨基酸残基可包含为了化学偶联目的添加的一个或更多 个氨基酸残基，其可例如允许将ABD结合多肽偶联至树脂或基质上，例如S印harose基树脂 或SulfoLink偶联树脂。这样的一个实例为添加半胱氨酸作为添加的氨基酸残基，或作为 许多添加的氨基酸残基中的一个。在一个实施方案中，本文公开的ABD结合多肽包含在多 肽的C末端（C-terminalend)，例如在C末端（C-terminus)的半胱氨酸残基。在一个实施 方案中，所述半胱氨酸为C末端添加的三肽VDC的部分。在一个实施方案中，所述半胱氨酸 为单独的C末端C。
[0218] 在一个特别地具体实施方案中，ABD结合多肽包含两个如以上定义的ABD结合结 构域的二聚体，以及C末端半胱氨酸残基。
[0219] 此类添加的氨基酸残基还可提供用于纯化或检测多肽的"标签"，诸如His6标签或 "myc"（c-myc)标签或"FLAG"标签用于与特异于该标签的抗体相互作用或在His6标签的 情况下用于固定化金属亲和层析法（IMAC)。
[0220] 如以上讨论的另外氨基酸可借助于化学共轭（使用已知的有机化学方法）或借助 于任何其他方式诸如表达作为融合蛋白的ABD结合多肽来偶联到ABD结合多肽。
[0221] 在另外的方面，提供编码如以上描述的ABD结合多肽的多核苷酸。包含此多核苷 酸的表达载体可使得能够例如通过在宿主细胞中的表达来产生ABD结合多肽。用于本文公 开的ABD结合多肽的表达的此类工具以及使用其用于ABD结合多肽的重组生产的方法被包 含于本公开内容中。
[0222] 在本发明的另一个实施方案中，提供ABD结合多肽和可检测的剂的组合。在一个 特定实施方案中，可检测的剂选自荧光剂和放射剂。荧光可检测剂包括荧光多肽，诸如绿色 荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶和其变体。可用于该上下文中的放射可检测的剂包括例 如放射性核素诸如 3H和1251。
[0223] 尽管本发明已经参考多个示例性实施方案进行了描述，本领域技术人员将理解的 是，可以做出不同的改变并且多种等价物可以由其要素所代替，而不脱离本发明的范围。另 外，可以做出许多修改以使特定的情况或分子适应本发明的教导，而不脱离本发明的基本 范围。因此，预期本发明不限于为进行本发明而考虑的任何具体实施方案，而是本发明将包 括落入所附权利要求书范围内的所有实施方案。
[0224] 附图简沐
[0225] 图1为包含在本发明的ABD结合多肽中的ABD结合基序的实例（SEQIDN0:1-52)、 根据本发明的49-merAK)结合多肽的实例（SEQIDN0:53-104)、根据本发明的58-merABD 结合多肽的实例（SEQIDNO: 105-156)、以及用于选择和筛选、或在用于阐述本发明的融合 蛋白中使用的白蛋白结合结构域变体的序列（SEQIDN0:157-162)的氨基酸序列列表。
[0226] 图2显示如在实施例1中所描述的，ELISA中对于以2yg/ml的生物素化的 PEP07911来检验的Z变体的选择的响应。通过将吸光度除以来自ELISA板上的阳性对照的 信号来归一化该响应。
[0227] 图3显示如实施例1所述进行的，对于在封闭ELISA检验中Z变体的选择的响应。 在添加l〇x过量HSA或不添加10x过量HSA的情况下，针对0. 2yg/ml的PEP07911测试Z 变体的周质制备物。黑色条相应于不含HSA的样品和灰色条相应于含作为封闭剂被添加的 HSA的样品。
[0228] 图4显示来自实施例3中所述的柱研宄I的结果。在图表中的条代表在表1中阐 述的不同洗涤和洗脱步骤之后从每个ABD结合Z变体偶联的树脂中释放的样品的相对量。
[0229] 图5显示来自实施例3中所述的柱研宄II的结果。图5A代表在分别用0. 1M柠 檬酸钠，pH3. 0或0. 5MHAc，pH2. 5的第一洗脱（a)或第二洗脱（b)之后，从每个ABD结 合Z变体偶联的树脂、或从被包括作为参考的HSA-Sepharose树脂中释放的样品的相对量。 图5B显示从在图5A中从Z变体偶联的树脂洗脱的相应级分的SDS-PAGE分析的结果。"M" 是指NovexSharp预染色蛋白标准（Invitrogen;Mw: 216、160、110、80、60、50、40、30、20、 15、10、3. 5kDa)且"上样的样品"是指包含PEP08515的细菌提取物，其最初上样到每种Z 变体偶联的树脂上的包含PEP08515的细菌提取物。将来自Z变体偶联的树脂的20y1洗 脱液、5y1的蛋白标准或细菌提取物上样到每种SDS-PAGE凝胶的一个泳道。图5C显示图 5A中从HSAS印harose树脂洗脱的相应级分的SDS-PAGE分析的结果。泳道1 :用0. 1M柠 檬酸钠，pH3. 0(pH3 (a))的首次洗脱。泳道2 :用0. 1M柠檬酸钠，pH3. 0(pH3 (b))的第 二次洗脱。泳道3 :用0? 5MHAc，pH2. 5(pH2. 5 (a))的首次洗脱。泳道4 :用0? 5MHAc，pH 2. 5(pH2. 5 (b))的第二次洗脱。将每种20y1洗脱液上样到SDS-PAGE凝胶中。"M"是指 NovexSharp预染色蛋白标准（Invitrogen;Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、 3. 5kDa)，其上样 5yl。
[0230] 图6显示来自如在实施例4中描述进行的在与His6_ (Z06677) 2_Cys偶联的 EAH-S印harose树脂上ABD-融合蛋白（实线）的亲和纯化的色谱图。与HSA偶联的 S印harose树脂上相同样品（断线）的纯化被包括用于参考。样品注入点用箭头表示。A和 B表示流通级分，且C和D表示洗脱级分，分别来自于His6-(Z06677) 2-Cys偶联树脂和HSA 偶联树脂。用范围从pH5.5到pH2.3的线性pH线性梯度进行洗脱。通过HPLC系统的内 置pH计监测pH(虚线）。
[0231] 图7显示如在实施例4中所示并如在实施例4中进一步所描述的来进行的反复碱 孵育之后测量的，偶联到EAH-S印harose树脂上的His6-(Z06677) 2-Cys(实线）的动力学结 合容量。偶联到Sepharose树脂的HSA(虚线）的结合容量被包括用于参考。
[0232] 图8A显示如实施例7所述进行的在抗ABD琼脂糖上的ABD融合蛋白PEP10986的 亲和纯化的色谱图。样品注射点用箭头表示。显示在280nm的吸光度信号（实线）。FT和 E分别指流通级分和洗脱级分。用0. 1MHAc，pH2. 9进行洗脱，且通过HPLC系统的内置pH 计监测pH(虚线）。
[0233] 图8B显示来自实施例7所述的纯化的选择级分的SDS-PAGE分析的结果。泳道1 : 上样到柱上的澄清的细菌提取物，泳道2 :级分E1，泳道3 :级分E2,和泳道4 :级分E3。"M" 是指NovexSharp预染色蛋白标准（Invitrogen;Mw: 216、160、110、80、60、50、40、30、20、 15、10、3. 5kDa)。除了泳道2上样1. 25y1，将5y1的每种样品上样到SDS-PAGE凝胶的各 自泳道中。
[0234] 图9A显示如实施例8所述进行的在抗ABD琼脂糖上的ABD融合蛋白PEP03973的 亲和纯化的色谱图。样品注射点用箭头表示。显示在280nm的吸光度信号（实线）。FT和 E分别指流通级分和洗脱级分。用0. 1MHAc，pH2. 9进行洗脱，且通过HPLC系统的内置pH 计监测pH(虚线）。
[0235] 图9B显示来自实施例8所述的纯化的选择级分的SDS-PAGE分析的结果。泳道1 : 上样到柱上的澄清的细菌提取物，泳道2和泳道3 :流通级分，泳道4 :级分E1，泳道5 :级分 E2,泳道6 :级分E3,泳道7 :级分E4,泳道8 :级分E5。"M"是指NovexSharp预染色蛋白标 准（Invitrogen;Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、3. 5kDa)。将 5y1 的每种样 品上样到SDS-PAGE凝胶的各自泳道中。
[0236] 图10A显示如实施例9所述进行的在抗ABD琼脂糖上的ABD融合蛋白PEP06548 的亲和纯化的色谱图。样品注射点用箭头表示。显示在280nm的吸光度信号（实线）。FT 和E分别指流通级分和洗脱级分。用0. 1MHAc，pH2. 9进行洗脱，且通过HPLC系统的内置 pH计监测pH(虚线）。
[0237] 图10B显示来自实施例9所述的纯化的选择级分的SDS-PAGE分析的结果。泳道 1:上样到柱上的澄清的细菌提取物，泳道2:级分El。"M"是指NovexSharp预染色蛋白 标准（Invitrogen;Mw:216、160、110、80、60、50、40、30、20、15、10、