式添加或 不添加HSA的样品。
[0259] 结果
[0260] ABD结合Z夺体的噬菌体展示诜择:在针对牛物素化ABD的不同变体的三个噬菌 体展示选择循环之后获得单个克隆。每个循环增加噬菌体颗粒收率（出去的噬菌体颗粒/ 进入的噬菌体颗粒），表明在靶结合克隆中的富集。
[0261]Z变体的ELISA筛诜:在96孔板中产生在三个选择循环之后获得的克隆，并在 ELISA中筛选ABD结合活性。在图2中示出针对PEP07911检验的阳性克隆（相应于至少 2x阴性对照的信号）的选择结果。对不相关蛋白特异性的对照分子给出对特异性蛋白的阳 性信号，然而针对PEP07986或PEP07911没有获得信号。
[0262]封闭ELISA:对PEP07986或PEP07911的阳性对照进行包括HSA的封闭检验，以观 察Z变体是否具有与天然配体HSA的重叠结合位点。对于所有测试的克隆，通过HSA的存 在使对PEP07911的结合信号完全消失，达到如背景的相同水平（图3)。阳性对照的结合不 受添加过量HSA的影响，且空白没有显示背景信号。
[0263] 通违:对在ELISA筛选中针对ABD具有阳性吸光度值的克隆进行测序。对每个变体 给出独特的标识号#####，且将单独变体称为Z#####。在图1中列出58个氨基酸残基长的 Z变体的氨基酸序列，且在序列表中为SEQ IDN0:105-156。这些Z变体的推导ABD结合基 序表示为并在图1中列出，且在序列表中为SEQ IDN0:1-52。将被预测组成这些 Z变体的每个中的完整三螺旋束的49个氨基酸残基长的多肽的氨基酸序列表示为 并在图1中列出，且在序列表中为SEQ IDN0:53-104。
[0264]实施例2
[0265] ABD结合Z夺体的克降和产牛
[0266] 材料和方法
[0267]Z夺体的亚克降:将 7个ABD结合夺体的DNA，Z06608(SEQIDN0:107)、Z06620(SEQ IDN0:110),Z06638(SEQIDNO:106),Z06650(SEQIDNO:108),Z06677(SEQIDNO:105), Z06678(SEQIDN0:109)和Z06695(SEQIDN0:111)从文库载体pAY02047 中扩增。使用标 准分子生物学技术并如在W0 2009/077175中对Z变体结合另一个靶详细描述的，应用了用 于构建带有N端His6标签和C端Cys的二聚Z变体分子的亚克隆策略。将Z基因片段亚 克隆到表达载体PAY01449,产生编码的序列MGSSHHHHHHLQ-[Z#####] [Z#####]-VDC。
[0268]培养和纯化：用包含每种各种Z变体的二聚基因片段的质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3)细胞（Novagen)，并在37°C下在补充有50yg/ml卡那霉素的1升的TSB+YE培养 基（含酵母提取物的胰蛋白大豆肉汤）中培养。在〇D_= 1下，以0. 17mM的终浓度添加 IPTG以诱导蛋白表达且在37°C下孵育培养物持续另外5小时。通过离心收获细胞。
[0269] 将4. 8克的每种细胞小团重悬于补充有29U/mlBeilZOliase? (Merck，目录号 1. 01654. 0001)的30ml变性结合缓冲液（20mM磷酸钠、0. 5MNaCl、20mM咪唑、8M尿素，pH 7. 4)，并在室温下震荡孵育1小时以释放表达的蛋白。通过离心去除细胞碎片且将每种上 清液应用于lmlHisGraviTrapIMAC柱（GEHealthcare，目录号 11-0033-99)。通过用 变性结合缓冲液、天然结合缓冲液（20mM磷酸钠、0. 5MNaCl、20mM咪唑，pH7.4)和洗涤缓 冲液（20mM磷酸钠、0. 5MNaCl、60mM咪唑，pH7.4)洗涤去除污染物且随后用洗脱缓冲液 (20mM磷酸钠、0. 5MNaCl、250mM咪唑，pH7. 4)洗脱ABD结合Z变体。通过尺寸排阻色谱 法将每种纯化的ABD结合Z变体转移到10mMNH4HC03。通过使用NaiioDrop?ND-1000分 光光度计并使用各自蛋白的消光系数，测量在280nm的吸光度确定蛋白浓度。冻干ABD结 合Z变体并通过用考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析终产物的纯度。使用HPLC-MS分析确认 每种纯化的ABD结合Z变体的身份。
[0270] 结果
[0271]培养和纯化:在大肠杆菌自好表汰构律为二聚体并带有N端His。标答和C端Cys 的 7 个ABD结合变体Z06608(SEQIDN0:107)、Z06620(SEQIDN0:110)、Z06638(SEQID N0:106)、Z06650(SEQIDN0:108)、Z06677(SEQIDN0:105)、Z06678(SEQIDN0:109)* Z06695(SEQIDNO: 111)。通过测量在280nm的吸光度来分光光度确定的来自4. 8克细菌 小团的IMAC-纯化的蛋白的量，对于不同ABD结合Z变体为从3mg到19mg的范围。
[0272] 每种最终蛋白制备物的SDS-PAGE分析显示，这些蛋白制备物主要包含各自的ABD 结合Z变体。通过HPLC-MS确认每种ABD结合Z变体的正确分子量。
[0273]实施例3
[0274] ABD结合Z夺体的结合和洗脱特征的评价
[0275] 在此实施例中，使用旋转柱以小规模的形式研宄如实施例1和实施例2中所述分 别选择和产生的一组ABD结合多肽的结合和洗脱特征。
[0276] 材料和方法
[0277]ABD结合Z夺体偶联到树脂:将以如实施例2所述产生的His6_ (Z#####) 2_Cys形 式的lmg的每种冻干的ABD结合Z变体Z06608、Z06620、Z06638、Z06650、Z06677、Z06678 和Z06695重悬于还原缓冲液（50mMTris-HCl、5mMEDTA、20mMDIT，pH8. 5)中并在室温 下孵育2小时。使用尺寸排阻色谱法将还原的蛋白溶液转移到包括50mMDTT的偶联缓冲 液（50mMTris-HCl、5mMEDTA，pH8.5)中，且然后与 0.2mlSulfoLink偶联树脂（Thermo FisherScientific，目录号20401)的部分混合。此步骤使得ABD结合Z变体的C端半胱氨 酸残基的硫醇基团与树脂的碘乙酰基团之间的定向位点反应成为可能，形成共价硫醚键。 根据制造商的说明书进行偶联反应。如下确定定义为每毫升树脂毫克偶联的ABD结合Z变 体的偶联度：基于通过分光光度测量在280nm的吸光度获得的浓度，通过从样品的原始量 中减去未偶联的材料的量计算偶联的ABD结合Z变体的量。然后，用mg计的偶联的ABD结 合Z变体的量除以SulfoLink偶联树脂的体积。
[0278]梓研究I:伸用纯样品评价ABD结合Z夺体偶联的树脂:讲行第一梓研究以测试偶 联到树脂的7种ABD结合Z变体中每种的结合、洗涤和洗脱性质，并通过使用ABD融合蛋白 PEP08517的先前纯化的样品。PEP08517包含在其N端融合到蛋白Z的细胞因子结合变体 的白蛋白结合结构域PP〇13(SEQIDN0:160)。将树脂的0.lml部分转移到测试管中且添 加偶联缓冲液中以2mg/ml的0.lml的PEP08517的纯样品。室温下，在旋转轮中孵育试管 1小时。将每种样品树脂混合物转移到空的旋转柱。通过离心收集未结合的蛋白（流通， FT)。此后，添加在表1中详述的0.lml不同溶液以洗涤并随后洗脱结合的PEP08517分子。 通过离心收集每种洗涤和洗脱级分。
[0279] 通过测量在280nm的吸光度在分光光度计中分析收集的级分。
[0280] 表1.在柱研宄I中样品和溶液的规格
[0281]
【主权项】
1. ABD结合多肽，所述ABD结合多肽包含ABD结合基序BM，所述基序由选自以下的氨基 酸序列组成： i) EX2X3X4AX6X7EIX 10XnLPNLX16X17X18QX 20X21AFIX25X26LX28D 其中，彼此独立地， X2选自F、I和L ; X3选自 H、K、N、Q、R、S、T和 V; 父4选自六、0、卩、6、11、1、1(、1、]\1、队〇、1?、5、1\￥、1和￥ ; X6选自F、I、L和Y; X1。选自 G、H、K、N、Q、R和 S ; X16选自 MPT; X17选自 F、H、L、S 和 T ; X1;^&gD、E、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、I^PV; X2。选自H、K和R; X21选自I、L和V ; X25选自 F、I、L、V和 Y ; X26选自K和S ; X28选自D和E ; 和 ii) 与在i)中定义的序列具有至少89%同一性的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的ABD结合多肽，其中序列i)满足8种条件I-VIII中的至少 4种： I. 父2为F或L ; II. XAF 或L ; III-X16St ; IV. X2tl为 H 或 R ; V. 父21为I或L ; VI. 父25为I或V ; VII. X26Sk;和 VIII-X2i^D0
3. 根据前述权利要求中任一项所述的ABD结合多肽，其中序列i)选自SEQ ID NO:1-52〇
4. 根据权利要求3所述的ABD结合多肽，其中序列i)选自SEQ ID NO: 1-7。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的ABD结合多肽，其中所述ABD结合基序形成三螺 旋束蛋白结构域的部分。
6. 根据权利要求5所述的ABD结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自来自金黄 色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的蛋白A的结构域或其衍生物。
7. 根据前述权利要求中任一项所述的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列： iii) K-[BM]-DPSQS XaXbLLXe EAKKL NDXdQ; 其中 [BM]为如在权利要求1-4中任一项定义的ABD结合基序； Xa选自A和S ; Xb选自N和E ; X。选自A、S和C ; Xd选自A和S ; 和 iv) 与由iii)定义的序列具有至少81 %同一,性的氨基酸序列。
8. 根据权利要求7所述的ABD结合多肽，其中序列iii)选自SEQ ID N0:53-104中任 一个。
9. 根据权利要求8所述的ABD结合多肽，其中序列iii)选自SEQ ID NO: 53-59中任一 个。
10. 根据权利要求6所述的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列： ADNNFNK-[BM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK ； ADNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK ； ADNKFNK-[BM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK ； ADAQQNNFNK-[BM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK ; AQHDE-[BM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK ； VDNKFNK-[BM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK ； AEAKYAK-[BM]-DPSESSELLSEAKKLNKSQAPK ； VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK ； VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDSQAPK ； AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK ； VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK ; VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK ;和 AEAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNKAQAPK ; 其中[BM]为如权利要求1-4中任一项定义的ABD结合基序。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的ABD结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列： xi) VDAKYAK-[BM]-DPSQSSELLAEAKKLNDAQAPK ； 其中[BM]是如权利要求1-4中任一项定义的ABD结合基序；和 xii) 与在xi)中定义的序列具有至少84%同一,性的氨基酸序列。
12. 根据权利要求11所述的ABD结合多肽，其中序列xi)选自SEQ ID NO: 105-156。
13. 根据权利要求12所述的ABD结合多肽，其中序列xi)选自SEQ ID NO: 105-111。
14. 多核苷酸，所述多核苷酸编码根据前述权利要求中任一项的多肽。
15. 根据权利要求1-13中任一项所述的ABD结合多肽与可检测剂的组合。
【专利摘要】本公开内容提供包含ABD结合基序BM的ABD结合多肽，该基序由选自由EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LX28D和与其具有至少89％同一性的氨基酸序列的氨基酸序列组成。
【IPC分类】G01N33-68, C07K14-00, C07K14-195
【公开号】CN104854127
【申请号】CN201380065194
【发明人】佩尔·乔纳森, 帕尔·埃克隆德
【申请人】阿菲博迪公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2013年10月25日
【公告号】CA2889037A1, EP2912054A1, WO2014064237A1