3. 5kDa)。将 5y1 上样到 SDS-PAGE凝胶的泳道M和泳道1且将5. 8y1上样到泳道2中。
[0238] 图11A显示如实施例10所述进行的在抗ABD琼脂糖上的ABD融合蛋白PEP17081 的纯化的色谱图。显示在280nm的吸光度信号（实线）和电导率（虚线）。样品注射点用 箭头表示。FT和E分别指流通级分和洗脱级分。
[0239] 图11B显示来自实施例10所述的纯化的不同阶段的选择级分的SDS-PAGE分析的 结果。泳道M:5ulNovexSharp预染色蛋白标准，Invitrogen(216、160、110、80、60、50、 40、30、20、15、10、3. 5kDa)。泳道1 :上样到抗ABD琼脂糖柱上的5y1澄清的、热处理的大 肠杆菌（E.coli)裂解物。泳道2 :来自抗ABD琼脂糖柱的5y1流通级分（flow-through) (在图11A中的FT)。泳道3 :来自抗ABD琼脂糖柱的3. 6y1的洗脱池（在图11A中的E)。 泳道4 :通过RPC(反相色谱）和缓冲液交换进一步纯化的12y1的PEP17081。
[0240] 图12A显示来自如实施例11所述进行的在抗ABD琼脂糖上的，包含在其C末端与 蛋白激素融合的ABD035(SEQIDN0:159)的蛋白1的亲和纯化的色谱图。样品注射点用箭 头表示。显示在280nm的吸光度信号（实线）和电导率（虚线）。FT、W和E分别指流通级 分、洗涤级分和洗脱级分。第一洗涤步骤W1用4CV的TST进行，且第二洗涤步骤W2用3CV的 5mMNH4Ac,pH5. 5 进行。
[0241] 图12B显示来自实施例11所述的纯化的选择级分的SDS-PAGE分析的结果。泳 道1-3 :SEC纯化的蛋白：10yg(l)、5yg(2)和lyg(3)。泳道4 :上样到抗ABD琼脂糖柱 上的蛋白样品，即在TST中以1:10稀释的SEC纯化的蛋白。泳道5 :20倍浓缩的FT。泳道 6 :60倍浓缩的W1。泳道7、8和9 :分别为10yg(7)、5yg(8)和lyg(9)的洗脱的蛋白。 标记"M" 的泳道用蛋白分子量标志（Mw:200、116. 3、97. 4、66. 3、55. 4、36. 5、31、21. 5、14. 4、 6、3.5、2.5kDa)来上样。箭头指示污染蛋白的微弱条带，其在仅通过SEC纯化的样品中的 SDS-PAGE凝胶上可见，但其通过在抗ABD琼脂糖树脂上的纯化有效地去除。
[0242] 图13A显示来自如实施例12所述进行的在抗ABD琼脂糖上的，包含在其N末端与 肽激素融合的ABD035(SEQIDN0:159)的蛋白2的亲和纯化的色谱图。样品注射点用箭头 表示。显示在280nm的吸光度信号（实线）和电导率（虚线）。FT、W和E分别指流通级 分、洗涤级分和洗脱级分。第一洗涤步骤W1用8CV的TST进行，且第二洗涤步骤W2用3CV 的 5mMNH4Ac,pH5. 5 进行。
[0243] 图13B显示来自实施例12所述的纯化的选择级分的SDS-PAGE分析的结果。泳道 1 :上样到抗ABD琼脂糖柱上的蛋白样品。泳道2 :FT。泳道4-6 :洗涤级分。泳道7-13 :在 图13A中标记的双峰内的洗脱的蛋白级分。相应于双峰内第一峰的级分上样到泳道7-10。 标记"M" 的泳道用蛋白分子量标志（Mw:200、116. 3、97. 4、66. 3、55. 4、36. 5、31、21. 5、14. 4、 6、3. 5、2. 5kDa)来上样。 实施例
[0244] 遍及此研宄使用以下材料，除非另外说明：
[0245] ?大肠杆菌（Escherichiacoli)菌株XLl-Blue(AgilentTechnologies,目录号 200268)
[0246] ?基本如在W02009/016043或W02012/004384中所述制备的白蛋白结合结构域 ABD001(SEQIDNO:157),C-ABD001(SEQIDNO:158).ABD035(SEQIDNO:159),PP013(SEQ IDN0:160)、PEP07986(SEQIDN0:161)和PEP07911(SEQIDN0:162)。
[0247] 实施例1
[0248] ABD结合Z夺体的诜择和筛诜
[0249] 材料和方法
[0250] 靶蛋白的牛物素化:伸用EZ-Link马来酰亚胺PEG。-牛物素（Pierce,目录号 21901)将带有N端半胱氨酸的ABD001(C-ABD001;SEQIDN0:158)和PEP07911(SEQID N0:162)生物素化。简言之，将蛋白溶解于50mM磷酸钠、150mMNaCl、2mMEDTA，pH7.5 中。添加二硫苏糖醇〇TT)至20mM的终浓度且用滚转（end-over-end)混合将样品在34°C 下孵育1小时。使用一次性ro-10柱（GEHealthcare,目录号17-0851-01)将缓冲液交 换为轭合缓冲液（50mM磷酸钠、150mMNaCl、lmMEDTA，pH7. 0)。将5倍（5x)过量摩尔 的EZ-Link马来酰亚胺PEG2-生物素（溶解于轭合缓冲液）添加到蛋白样品中并在室温 下（RT)伴随滚转混合继续孵育2小时。随后使用ro-10柱进行将缓冲液交换为PBS(10mM 磷酸盐、137mMNaCl、2. 68mMKCl，pH7. 4)。根据制造商的建议使用10x过量摩尔的 No-WeighEZ-Link磺基-NHS-LC-生物素（Pierce，目录号21327)在室温下将PEP07986(SEQ IDN0:161)生物素化30分钟。随后根据制造商的说明书使用透析盒（Slide-a-lyzer 3. 5K, 3500MWC0,Pierce，目录号66333)进行将缓冲液交换为PBS。
[0251] 口策菌体展示选择ABD结合Z变体:基本按照在Gronwall等（J Biotechnol, 128:162-183,2007)中描述的，在噬菌粒pAY02047中构建的，在细菌噬菌体上 展示的蛋白Z的随机变体文库用于选择ABD结合多肽。文库Zlib004Naive.I利用TaqDNA 多聚酶结合分子Z03639(描述于Gunneriusson等，ProteinEng12:873-878, 1999 中，其 中它被表示为作为融合伴侣。文库具有1.4x101(1个变体的实际大小。
[0252] 在20升发酵罐中制备噬菌体储备液。在20升补充有2 %葡萄糖和100yg/ml氨 苄青霉素的TSB-YE(胰蛋白酶大豆肉汤-酵母提取物；30g/lTSB、5g/l酵母提取物）中孵 育来自包含噬菌粒文库Zlib004Naive.I的甘油储备液的细胞。在37°C下在发酵罐（Belach Bioteknik，BR20)中生长培养物。当细胞达到0. 7-0. 8的光密度（0D)时，使用10x过量摩 尔的M13K07辅助噬菌体（NewEnglandBiolabs，目录号N0315S)感染大约2. 6升培养物。 孵育细胞30分钟，随后用补充有0.ImMIPTG(异丙基--D-1-硫代半乳糖苷，用于诱导表 达）、25yg/ml卡那霉素和12. 5yg/ml羧苄青霉素的TSB-YE填充发酵罐至20升，且细胞 在3〇°C下生长22小时。如在Grdnwall等，以上中所述的，通过在I5900g离心使在培养中 的细胞形成小球且留在培养基中的噬菌体颗粒在PEG/NaCl(聚乙二醇/氯化钠）中沉淀2 次、过滤并溶解于PBS和甘油中。使用之前将噬菌体储备液储存在-80°C下。
[0253] 针对生物素化的ABD的不同变体进行三个循环的选择。噬菌体储备液制备、选 择程序和在选择循环之间的噬菌体的扩增基本如在W02009/077175针对另外一个靶的选 择所描述的进行。补充有〇. 1 %明胶和〇. 1 %吐温20的PBS被用作选择缓冲液且通过 Dynabeads? M-280链霉亲和素（Dynal，目录号112.06)直接捕获靶-噬菌体复合物。每 0. 25ygABD使用lmg珠。大肠杆菌菌株XLl-Blue被用于噬菌体扩增。选择以分为三个 途径（track)的三个循环进行：一个途径使用PEP07911，一个途径使用C-ABD001且一个途 径在C-ABD001和PEP07986之间交替。在选择的循环1中，在不同选择途径中使用100nM PEP07911或C-ABD001，且用0. 1%PBST(补充有0. 1%吐温-20的PBS)进行2次洗涤。在 后续两个循环中应用了使用更低靶浓度和增加数量的洗涤的增加的严格性。对于仅具有一 个靶的选择途径，在循环2和3分别使用50nM之后使用25nMPEP07911或C-ABD001。在具 有交替靶的途径中，在循环2中使用75nM的PEP07986且在循环3中使用40nM的C-ABD001。 对于所有途径，在循环2和3中分别使用0. 1 %PBST进行4次和8次洗涤。在洗涤之后，用 500以10.1]\1甘氨酸-11(：14112.2洗脱结合的噬菌体，随后立即用5(^11'1^-11(：14118.0 和450y1PBS中和。在最后选择循环中，所有途径首先用0. 5MHAc，pH4. 0洗脱，随后如 上所述用甘氨酸-HC1洗脱。此后分别处理不同洗出液。
[0254] Z夺体的ELISA筛诜：为了核实诜择的Z变体分子确实可与ABD的不同变体相互 作用，进行ELISA检验。通过在深孔板（Nunc，目录号278752)中将来自选择的单克隆接种 到补充有100Ug/ml氨苄青霉素和0.ImMIPTG的lmlTSB-YE培养基来产生Z变体。在 37°C下孵育板18-24小时。通过离心使细胞形成小球，在400y1的0. 05%PBST中重悬且 在-80°C冷冻以释放细胞的周质级分。随后在水浴中将冷冻的样品解冻且重复冷冻-解冻 8次。将400ylPBST0.05%添加到样品中且通过离心使细胞形成小球。周质上清液包 含表示为AQHDEALE-[Z#####]-VDYV-[Z03639]-YVPG、作为融合到TaqDNA聚合酶结合分子 Z03639的Z变体。Z#####是指单独的58个氨基酸残基Z变体。
[0255] 用包含4yg/ml的Z变体特异性抗体（Affibody，目录号20. 1000. 01. 0005)的 50y1/孔的包被缓冲液（50mM碳酸钠，pH9. 6)包被一半面积的96孔ELISA板（Costar， 目录号3690)并在4°C下孵育过夜。倾倒抗体溶液并在室温下用100y1的PBSC(补充有 0. 5%酪蛋白的PBS;Sigma，目录号C8654)封闭孔2小时。丢弃封闭溶液且将50yl周质溶 液添加到孔中并在室温下在缓慢震荡下孵育持续1. 5小时。倾倒上清液并用0. 05%PBST洗 涤孔4次。然后，将PBSC中2yg/ml浓度的50y1生物素化PEP07986或PEP07911添加到 每个孔中。室温下孵育板1小时，随后如上述洗涤。将在PBSC中以1:30000稀释的链霉亲 和素-HRP(辣根过氧化物酶；ThermoScientific，目录号N100)添加到孔中且孵育板45分 钟。如上述洗绦之后，将 50ylImmunoPureTMB底物（ThermoScientific，目录号 34021) 添加到孔中且根据制造商的建议处理板。使用多孔板读数器Vict〇r3(PerkinElmer)在 450nm下测量孔的吸光度。
[0256] 作为阳性对照，针对5yg/ml的此生物素化的靶蛋白检测包含结合到无关但特异 性靶蛋白并如上表达的Z变体的周质级分。作为阴性对照，针对PEP07986或PEP07911检 测相同的周质制备物。对针对PEP07986或PEP07911具有阳性吸光度值的克隆进行测序。
[0257]测序:使用标准PCR程序和引物AFFI-21 (5'-tgcttccggctcgtatgttgtgtg; SEQIDN0:163)和AFFI_22(5' -cggaaccagagccaccaccgg;SEQIDN0:164)从单克隆 中以2个步骤扩增PCR片段。使用按照制造商的方案来使用的生物素化的寡核苷酸 AFFI-72 (5' -生物素-cggaaccagagccaccaccgg;SEQIDN0:165)和BigDye? 终止子 v3. 1循环测序试剂盒（AppliedBiosystems，目录号4336919)进行扩增片段的测序。使用 Magnatrix8000(MagneticBiosolution)通过结合到磁性链霉亲和素包被的珠（Detach StreptavidinBeads,Nordiag,目录号 2012-01)纯化测序反应，并在ABIPRISM? 3130x1 GeneticAnalyzer(PEAppliedBiosystems)上分析。
[0258]封闭ELISA:对来自最初ELISA筛选的克隆亚群进行ELISA封闭检验，以阐明其靶 结合是否受到HSA存在的影响。对于选择的Z变体，使用如上相同的周质级分。如ELISA 筛选检测运行ELISA封闭检验，伴随在靶步骤引入以下方案修改：在添加到检验板之前，将 HSA与靶蛋白混合。在添加到板之前，将0. 2yg/ml生物素化的PEP07911与10x过量摩尔 的HSA混合且然后室温下孵育15分钟以允许形成复合物。作为阳性对照，针对5yg/ml的 生物素化的特异性靶蛋白检测包含结合到无关靶蛋白并如上表达的分子的周质级分。作为 阴性对照，针对生物素化的PEP07911检测相同的周质制备物。作为空白，添加PBSC而不是 周质制备物且添加生物素化的PEP07911作为靶。所有对照制备为如以上相同方