在不存在全能核酸酶的情况下分离synagis*的方法
【专利说明】在不存在全能核酸酶的情况下分离synagis^的方法
[0001] 本申请包含一个经由EFS-Web向美国专利及商标局电子地提交为ASCII文本的序 列表，提交名称为"RSVAB-300P1_序列表_ST25.txt"，具有10千字节的大小并且创建日期 为2013年11月4日。该电子地提交的序列表充当37CFR§ 1. 821 (c)要求的纸质复印件以 及§1. 821(e)要求的CRF两者。该序列表中所含的信息通过引用结合在此。 发明领域
[0002] 本发明针对一种从组合物中分离抗体的方法。在一些实施例中，该方法包括从包 含Synagis"的组合物中分离Synagis% (帕利珠单抗），该方法包括：（i)对该组合物进 行一个离子交换色谱过程；（ii)对该组合物进行一个亲和纯化过程；以及（iii)对该组合 物进行一个过滤过程，其中一种终产物包括获得自（i)、（ii)、和（iii)的Synagis气其中 该终产物适合于向人类给予并且具有< 〇.5pg/mg的DNA浓度，并且其中该方法不包括向该 组合物中添加全能核酸酶（benzonase)。 发明背景
[0003] 抗体已经用于各种疾病与病症的治疗并且总体上衍生自使用真核或原核细胞系 的细胞培养物。然而，在药物应用领域使用的抗体必须具有高纯度，尤其是对于来自细胞培 养物的污染物而言，该细胞培养物包括细胞蛋白污染物、细胞DNA污染物、病毒以及其他可 传染的药剂。参见"WHO关于在生物制品生产中作为体外基质的动物细胞的应用要求：关于 生物活性物质 No.50 的要求"（"WHO Requirementsfortheuseofanimalcellsasin vitrosubstratesfortheproductionofbiologicals:RequirementsforBiological SubstancesNo.50. "）878号，附录 1，1998。
[0004] 响应于关于污染物的关注点，世界卫生组织（WHO)对多种污染物水平进行设限。 例如，WHO建议对于蛋白产品而言每个剂量的DNA限值小于10ng。同样地，美国食品与药品 管理局（FDA)设定DNA限值为小于或等于0. 5pg/mg蛋白。
[0005] 为了实现药学上可接受的抗体要求的所需纯度水平，已经报道了用于分离抗体的 多种方法。这些方法典型地涉及多个步骤以及除了其他细胞产物和污染物外，宿主细胞DNA 清除的报告，以达到与政府监管的指导方针一致的纯度水平。这些分离步骤取决于不同因 子而变化，包括进行分离的抗体的特征、要产生的量、表达系统、以及生长培养基。然而，一 般而言该分离过程涉及用于表达抗体的细胞的初步裂解、DNA降解步骤、一个或多个色谱步 骤、病毒去除步骤、以及一个过滤步骤，仅举几例。
[0006] 确保必要纯度的过程可以是昂贵且耗时的。因此，经济有效纯化方法的发展对于 制药和生物技术工业越来越重要。 发明概述
[0007] 本发明针对一种从组合物中分离Synagis61的方法。在一些实施例中，该方法包 括从包含Synagi的组合物中分离Synagis气该方法包括：⑴对该组合物进行一个离 子交换色谱过程；（ii)对该组合物进行一个亲和纯化过程；并且（iii)对该组合物进行一 个过滤过程，其中一种终产物包括获得自（i)、（ii)、和（iii)的Synagis'其中该终产物 适合于向人类给予并且具有<〇.5pg/mg的DNA浓度，并且其中该方法不包括向该组合物中 添加全能核酸酶。
[0008] 在一些实施例中，该方法不包括添加一种外源核酸酶到该组合物中。
[0009] 在一些实施例中，本发明的方法进一步包括进行一个病毒灭活过程。例如，在一些 实施例中，该病毒灭活过程包括在pH小于4. 0下孵育该组合物。
[0010]
[0011] 在一些实施例中，该亲和纯化过程包括一个蛋白A纯化过程。在一些实施例中， 该离子交换色谱过程是一个阳离子交换色谱过程。在一些实施例中，该阳离子交换过程包 括使该抗体穿过选自下组的一种阳离子树脂，该组由以下各项组成：卡普托S(CaptoS)、 S_ 交联琼脂糖FF(S-S印haroseFF)、以及波罗斯 50HS(Poros50HS)。
[0012] 在一些实施例中，该方法进一步包括一个第二离子交换过程。在一些实施例中，该 第二离子交换过程是一个阴离子交换色谱过程。
[0013] 在一些实施例中，该阴离子交换过程包括使该抗体穿过选自下组的一种阴离子 膜，该组由以下各项组成：超级Q(SuperQ)、那翠丝Q(NatrixQ)、科罗马索布Q(Chromasorb Q)以及木斯塘Q(MustangQ)。
[0014] 在一些实施例中，该终产物具有>80% (mol/mol)的抗体得率。在一些实施例中， 该终产物的DNA浓度< 200ng/mg。
[0015] 在一些实施例中，该组合物选自下组，该组由以下各项组成：免疫动物血清、腹水 液、杂交瘤或骨髓瘤上清液、衍生自重组细胞系培养的条件培养基、以及产免疫球蛋白细胞 的细胞提取物。
[0016] 在一些实施例中，该组合物来自一个生物反应器。在一些实施例中，该组合物具有 大于100升的体积。在一些实施例中，该组合物具有大于1000升的体积。
[0017] 在一些实施例中，该亲和纯化过程发生在该离子交换过程后。在一些实施例中，该 过滤过程发生在该亲和过程后。
[0018] 在一些实施例中，该方法包括从包含Synagis?的组合物中分离Synagis?,该 方法包括：（i)对该组合物进行一个阳离子交换色谱过程以形成一种包含该抗体的第一产 物；（ii)添加一种缓冲液到该第一产物中以形成一种缓冲产物；（iii)对该缓冲产物进行 一个亲和纯化过程以形成一种包含该抗体的第二产物；（iv)对该第二产物进行一个过滤 过程以形成一种包含该抗体的第三产物；（v)对该第三产物进行一个病毒灭活过程；并且 (vi)配制该第三产物以形成一种终产物，其中该终产物包含Synagis?，Synagis?适合 于向人类给予并且具有<〇.5pg/mg的DNA浓度；其中该方法不包括向该组合物中添加全能 核酸酶。
[0019] 在一些实施例中，该方法包括从包含Synagis?的组合物中分离Synagis'该方 法包括下列（i)-(v)中的至少三个：（i)对该组合物进行一个阳离子交换色谱过程；（ii) 对该组合物进行一个亲和纯化过程；（iii)对该组合物进行一个超滤过程；（iv)对该组合 物进行一个病毒灭活过程；以及（V)对该组合物进行一个阴离子交换色谱过程；其中获得 自⑴-(v)中的至少三个的产物包含Synagis?，适合于向人类给予并且具有彡0. 5pg/mg 的DNA浓度；并且其中该方法不包括向该组合物中添加全能核酸酶。 附图简要说明
[0020] 图1是实例1中描述的"全能核酸酶"以及"无全能核酸酶"（benzonase-free)过 程的示意图。该过程包括阳离子交换色谱过程、三/氯化镁缓冲液添加、蛋白A色谱过程、 纳米过滤、低pH处理、以及阴离子交换色谱过程。
[0021] 图2是实例2中描述的过程的示意图。左栏表示其中在阳离子色谱过程后加或 "添加"（spike) 了DNA的分离过程。右栏表示其中在低pH处理过程之后添加了DNA的分 离过程。 发明详细说明
[0022] 本发明在部分上是基于在不存在全能核酸酶的情况下，对分离抗体或其片段的方 法的开发。在一些实施例中，本发明的方法提供分离的抗体，该方法包括：（i)对该组合物 进行一个离子交换色谱过程；（ii)对该组合物进行一个亲和纯化过程；以及（iii)对该组 合物进行一个过滤过程，其中一种终产物获得自（i)、（ii)、和（iii)，其中该终产物适合于 向人类给予并且具有< 0. 5pg/mg的DNA浓度，并且其中该方法不包括向该组合物中添加全 能核酸酶。在一些实施例中，该抗体具有大于8.0的等电点。在一些实施例中，该抗体具有 大于9. 0的等电点。
[0023] 在一些实施例中，本发明的方法使得制造商能够以更有效的方式生产适用于向 人类给予的抗体药物产品，该方式为通过降低成本、减少方法步骤、降低错误机会、降低不 安全或不适当添加剂引入的机会等等，通过省去全能核酸酶或在一些实施例中任何外源 核酸酶的添加。在本发明中，抗体可以在不添加全能核酸酶的情况下来分离，以前该全 能核酸酶已在适合于向人类给予的抗体的分离过程中被添加。全能核