t. Louis, M0; pp.45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) Piscataway，N. J.，pp. 384-391) 〇
[0059] II.材料 这些研究中纯化的所有载脂蛋白均在大肠杆菌中产生，并且分离为包涵体。ApoLl蛋 白包括：ApoLl野生型同种型（即EIK和KIK)、肾高风险变体（G1和G2)、ApoL2和狒狒 ApoLl。Phenyl Sepharose High Performance(苯基琼脂糖高效）和 Butyl Sepharose High Performance(丁基琼脂糖高效）来自 GE Healthcare (Piscataway，NJ，USA)， 且 Sartobind Salt Tolerant Anion Exchange (STIC)膜来自 Sartorius Stedim (Goettingen，Germany)。所有化学试剂均购自 Fisher Scientific (Pittsburgh，PA， USA)、Sigma Aldrich (St. Louis，M0，USA)或 Biorad (Hercules，CA，USA) 〇
[0060] III.层析 层析分离在 GE Healthcare Avant 系统上使用来自 GE Healthcare 的 Tricorn 5/200 或XK16、26或50柱进行。所有研究都使用30 - 250 cm/小时的线速度范围，其中柱负载 率为< 11克蛋白/每升树脂。将柱包装至8 - 22 cm的床高度，并且包装效率通过等于 彡1000板/米的理论板（HETP)的高度和0.8 - 1.8的峰值不对称因子范围的预设标准 而确保。
[0061] IV?分析方法 分析反相高效层析（RP-HPLC):RP-HPLC使用与在线保护过滤器(in-line guard filter) (ADV 0.5Wn Direct Connect In-Line Column Filter)偶联的Poros R2/10 2.1 x 30 mm分析柱（Applied Biosystems)进行。缓冲液A由水中的0.2 v/v% TFA组成，且缓 冲液B由90 v/v%乙腈中的0.2 v/v% TFA组成。样品注射到柱上之后，渐增乙腈的梯度用 于基于疏水性洗脱蛋白，其中较疏水种类在梯度中较晚洗脱。RP-HPLC方法由在70°C的1 ml/min的流速组成，其中运行时间为24分钟，运行后时间为2分钟。在280 nm波长的UV 信号测量蛋白浓度。
[0062]蛋白定量：总蛋白浓度使用来自 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)的NanoDrop型号2000c经由280nm的吸光度进行测定。从氨基酸序列计算出 1. 056 (ApoLl变体）、0. 627 (狒狒ApoLl)和0. 646 (Ap〇L2)的理论载脂蛋白消光系数，且用 于测定蛋白浓度。
[0063] 圆二代谱（⑶）：圆二代谱在来自Aviv Biomedical (420C)的分光光度计上进行。 将ApoLl野生型1:10稀释至不同缓冲液。对于缓冲液和蛋白溶液两者，监测椭圆率，数据 间距为0? 5nm，在250nm-198nm的间隔中的每个波长平均为2s (如果可能）。将三次扫描 平均化以获得最终光谱。使用具有1 mm光程的细胞比色杯，其中带宽被设定为1 nm。对于 数据分析，从蛋白扫描中减去缓冲液扫描。通过使用以下公式将扫描归一化至分子剩余重 量：
【主权项】
1. 重折叠和纯化细菌细胞中表达的脂蛋白的方法，其包括： a) 在增溶缓冲液中增溶和解折叠包涵体； b) 将含有所述脂蛋白的缓冲液的电导率调节到至少65 -130 mS/cm; c) 使所述脂蛋白结合在疏水相互作用层析（HIC)柱上； d) 用洗涤缓冲液洗涤所述HIC柱；和 e) 用梯度洗脱缓冲液或非梯度洗脱缓冲液洗脱所述脂蛋白，从而产生具有至少44% 的纯度的HIC柱洗脱液，如通过反相高效液相层析（RP-HPLC)所测定。
2. 权利要求1的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。
3. 权利要求1的方法，其中所述增溶缓冲液包含2% SDS、100mM Tris、100mM NaCl、 200mM精氨酸和8M尿素，pH 7至10。
4. 权利要求3的方法，其中将所述脂蛋白在所述增溶缓冲液中在15-30°C孵育一至 二十四小时。
5. 权利要求1的方法，其中用20 mM磷酸钠和1-2M硫酸铵将含有所述脂蛋白的缓冲液 的电导率调节至65 -100 mS/cm。
6. 权利要求1的方法，其中所述HIC柱负载有高达15克脂蛋白/每升HIC树脂。
7. 权利要求1的方法，其中所述洗涤缓冲液包含I M硫酸铵，pH 7。
8. 权利要求1的方法，其中所述梯度洗脱缓冲液包含约20 mM磷酸钠和I M硫酸铵， pH7(缓冲液A)至约20 mM磷酸钠，pH 7 (缓冲液B)的梯度，并且所述脂蛋白经20个柱体 积洗脱。
9. 权利要求8的方法，其中缓冲液A包含20 mM磷酸钠和0. 2至0. 3 M硫酸铵，pH 7， 与0至8M浓度的尿素。
10. 权利要求8的方法，其中所述梯度洗脱缓冲液B包含20 mM磷酸钠，pH 7,与0至 8M浓度的尿素。
11. 纯化载脂蛋白的方法，其包括： a) 以流通模式将权利要求1的HIC柱洗脱液负载至阴离子交换膜上，进料条件为pH 6.5 - 8.0,电导率为彡5至30 mS/cm，且膜负载率为至少50 mg蛋白/每mL膜； b) 用 pH 6. 5-8. 0 的 20mm HEPES 和 200mM NaCl 洗涤所述膜；和 c) 收集流通液。
12. 权利要求11的方法，其中所述负载条件是pH 6. 5 - 7. 5和彡5-20 mS/cm的电 导率。
13. 权利要求11的方法，其中所述阴离子交换膜是耐盐阴离子交换膜。
14. 权利要求11的方法，其中所述阴离子交换膜负载率为约200 mg蛋白/每mL膜。
15. 权利要求11的方法，其中所述载脂蛋白是ApoLl或ApoL2。
16. 对于载脂蛋白去除内毒素的方法，其包括： a) 通过向从阴离子交换膜收集的含有载脂蛋白的合并物添加盐酸胍而解折叠所述载 月旨蛋白； b) 将尿素和硫酸铵添加至所述合并物； c) 将所述载脂蛋白以流通模式负载至疏水相互作用层析（HIC)柱上； d) 用适当的洗涤缓冲液洗涤所述HIC柱；和 d)收集流通液。
17. 权利要求16的方法，其中所述含有载脂蛋白的合并物在以下条件下流通所述HIC 柱： a) pH 6. O - 7. 5 ； b) 130 - 170 mS/cm 的电导率； c) 2至6M盐酸胍； d) 以0. 5 - 3克载脂蛋白/每升树脂负载所述载脂蛋白； e) 0至0. 7M硫酸铵；和 f) 0至2.5M尿素。
18. 权利要求17的方法，其中所述疏水相互作用层析洗涤缓冲液是20 mM磷酸钠，6M 盐酸胍，0. 75M硫酸铵，pH 7。
19. 权利要求17的方法，其中所述载脂蛋白是ApoLl或Ap〇L2。
【专利摘要】提供了在层析柱上重折叠和纯化脂蛋白的方法。具体而言，提供了使用疏水相互作用柱(HIC)重折叠ApoL1多肽的方法。本发明提供了用于纯化人脂蛋白诸如ApoL1的活性形式的方法。更具体地，本发明涉及用于使用疏水相互作用柱将大肠杆菌中大量表达的蛋白的包涵体复性成活性形式和去除杂质(例如，内毒素)的方法。
【IPC分类】C07K14-775
【公开号】CN104854131
【申请号】CN201380066083
【发明人】R.A.齐米洛夫斯基, C.卡特勒, H.李, T.O.林登
【申请人】默沙东公司
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2013年12月19日
【公告号】WO2014100302A1