展性，因为透析速率不受控制。渗滤可以是替代方法，因为变性剂去除 的速率不是扩散限制的。但是，膜上变性蛋白的聚集可以限制其应用。
[0049] 凝胶过滤层析已经成功地用于重折叠分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、碳 酸酐酶和溶菌酶，但也可取决于缓冲液交换条件引起蛋白聚集（Buchner (1991) Biotechnol.9:157-162; Hamaker,等人.（1996) /￥〇#? 12:184-189;和 Bates等人.（1997) J J 766:109-119)。层析柱中的蛋白聚集可以通过将 蛋白结合至固定相和随后洗脱而防止（Negro,等人.（1997) 你沿1; 7化55以-599; Kim, 等人（1997)ProteinEngg. 10:455-A&2.' 取Qiu,等人?（1997)Protein你辟;7以suppl) : 33)。柱上重折叠的另一个关键的实际优点是，除了缓冲液交换以外，其允 许一定程度纯化期望产物。
[0050] Apo-Ll在大肠杆菌中作为包涵体细胞内产生。第一纯化步骤涉及包涵体增溶和 a螺旋部分解折叠。载脂蛋白使用含有100 mM Tris、100 mM氯化钠、200 mM精氨酸盐酸 盐、8M尿素和2 w/v%十二烷基硫酸钠（SDS)的缓冲液基质在约7至10的pH范围持续约 一至二十四小时在约15至30°C之间的温度部分解折叠。对于含有半胱氨酸残基的载脂蛋 白，将二硫苏糖醇（ImM)添加至解折叠缓冲液和随后的层析洗涤和洗脱缓冲液。
[0051] 由于载脂蛋白的高疏水性，使用苯基琼脂糖高效树脂的疏水相互作用层析（HIC) 用于重折叠和纯化Apo-Ll。用于Apo-Ll的该柱上重折叠程序与目前已知用于载脂蛋 白纯化和a-螺旋解折叠/重折叠的方法（Hunter,等人.（2008) 7； J 1204:42-47;和 Gross,等人.（2006)沿7； 90:1362-70)相比不同。尽管由不同 的疏水性配体构成的替代疏水性树脂的表现可以不与苯基琼脂糖HP树脂类似，但用于替 代疏水性树脂的最佳结合和洗脱条件可以使用本文公开的方法来确定。替代疏水性树脂的 市售实例包括但不限于：Butyl Sepharose HP、Capto Phenyl、Capto Butyl、Hexyl 650C 和Capto Octyl。将部分解折叠的载脂蛋白的电导率使用硫酸铵储液调整至近似65至130 mS/cm，并且以近似6至8的pH范围和彡11克蛋白/每升树脂负载至柱上。负载后，该柱 用约彡3个柱体积（CV)的20mM磷酸钠，1M硫酸铵pH 7洗脱。洗脱使用经约20个CV的 20mM磷酸钠，1M硫酸铵pH 7(缓冲液A)至20mM磷酸钠（缓冲液B)的线性梯度实现。洗 脱梯度可以从约20 %至30 %缓冲液A至100 %缓冲液B变化。缓冲液A和/或B也可以 含有至多达8M尿素。该柱用彡3个CV各去离子水，0. 5M氢氧化钠和1M氯化钠溶液再生。 将该柱储存在0. 1M氢氧化钠溶液中。疏水相互作用层析方法中使用的缓冲化合物包括磷 酸钠、硫酸铵和尿素。替代缓冲化合物可以包括但不限于ffiPES、tris、柠檬酸盐、乙酸盐、 硫酸钠、氯化钠或前述或其它缓冲剂的一些混合物。
[0052] 阴离子交换膜层析是疏水相互作用层析之后的随后纯化步骤。Sartobind耐盐阴 离子交换膜用于从目的载脂蛋白分离宿主细胞蛋白。使用本文公开的方法，替代耐盐阴离 子交换膜的市售实例包括但不限于Chromasorb。阴离子交换膜层析以流通模式使用近似 pH 6. 5至8.0和5至19 mS/cm的进料条件以彡200克蛋白/每mL膜的膜负载率操作。当 UV增加至125 mAu/cm时，产物收集开始。负载后，将膜用20 mM H印es，200 mM氯化钠pH 7. 4洗涤，直到UV降至低于125 mAu/cm。洗涤缓冲液还可以含有10 v%甘油。使用1M氯 化钠溶液将膜剥离。阴离子交换膜层析方法中使用的缓冲化合物包括ffiPES、氯化钠和甘 油。替代缓冲化合物可以包括但不限于tris或乙酸盐或前述或其它缓冲剂的一些混合物。
[0053] 以流通模式操作的疏水相互作用层析步骤是最后的纯化步骤。苯基琼脂糖HP或 丁基琼脂糖HP用于从目的载脂蛋白分离内毒素。使用本文公开的方法，替代疏水相互作 用层析树脂的市售实例包括但不限于Capto Phenyl、Capto Butyl、Hexyl 650C和Capto Octyl。将HIC进料的电导率使用尿素、盐酸胍和硫酸铵的任何组合调整至近似160 mS/cm， 并且负载至柱上直至3克载脂蛋白/每升树脂。当UV增加至125 mAu/cm时，产物收集开 始。负载后，将该柱用20 mM磷酸钠、6M盐酸胍、0.75M硫酸铵pH 7洗绦，直到UV降至低于 125 mAu/cm。该柱用彡3个CV各去离子水，0.5M氢氧化钠和1M氯化钠溶液再生。异丙醇 (20 v%)用作替代柱再生溶液。将该柱储存在0. 1M氢氧化钠溶液中。疏水相互作用层析方 法中使用的缓冲化合物包括磷酸钠、硫酸铵、尿素和盐酸胍。替代缓冲化合物可以包括但不 限于HEPES、tris、柠檬酸盐、乙酸盐、硫酸钠、氯化钠或前述或其它缓冲剂的一些混合物。
[0054] 过程杂质诸如内毒素、宿主细胞蛋白和蛋白片段的去除是极端复杂的且难以使用 传统层析方案实现。为了克服纯化挑战，本发明涉及通过鉴定适当的赋形剂诸如去污剂和 变性剂组合（其引起载脂蛋白的部分或完全解折叠）而调节分子的自我结合行为。评估层 析树脂和膜，并且基于其扩增赋形剂与ApoLl的相互作用的能力选择，用于基于蛋白的折 叠状态选定清除过程杂质。开发3步骤纯化方案以去除近似2至9 log1(l的内毒素，宿主细 胞蛋白清除直至2 log1Q，并且通过反相HPLC导致多44%的最终纯度。该纯化方法已成功 应用于三种人ApoLl变体连同人Ap 〇L2和狒狒ApoLl。
[0055] 本发明的广泛范围参照以下实施例最好地理解，所述实施例并不意在将本发明限 制至具体实施方案。 实施例
[0056] I ?通用方法。
[0057] 分子生物学中的标准方法描述于Sambrook，Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 第 2 版，2001 第 3 版）Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) MolecularCloning，寬，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993)RecombinantDNA,Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA)。标准方法还出现于 Ausbel，等人.（2001) i/? Biology，John Wiley and Sons，Inc. New York，NY，其描述了细菌细胞中的 克隆和DNA诱变（第1卷）、哺乳动物细胞和酵母中的克隆（第2卷）、糖缀合物和蛋白表 达（第3卷）和生物信息学（第4卷）。
[0058] 描述了用于蛋白纯化的方法，包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶（Coligan， 等人? （2000)CurrentProtocolsinProteinScience,Vol. 1,John Wiley and Sons, Inc.，New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产、蛋白的糖 基化（参见，例如，Coligan，等人?（2000)CurrentProtocolsinProteinScience, ?之，John Wiley and Sons，Inc.，New York; Ausubel，等人?（2001) ProtocoIsinMolecularBiology，VoL3,John Wiley and Sons, Inc. , NY, NY, pp. 16. 0. 5-16. 22. 17; Sigma-Aldrich，Co. (2001)ProductsforLifeScience Research,S