0);使用计算机程序Microsoft Excel和 GraphPad Prism 5软件进行数据处理和制图，并计算出各试验药物的EC50。
[0107] 实验结果 1各药物干预后细胞内的总蛋白浓度（mg/ml) 非干扰型蛋白浓度测定试剂盒的可靠定量范围是1 一 50 μ g，在此范围内，标准品BSA 与吸光值成浓度依赖关系，拟和曲线为y=a+bx+cx~2,其中，a、b、c为常数，a=0. 54543092， b=-0. 028833977, c=0. 00059713018,相关系数r大于0.99,标准曲线如图11。根据标准曲 线和待定量的蛋白质样品溶液的480nm吸收值计算出各样品的总蛋白浓度，如表1。
[0108] 表1各组样品的总蛋白浓度（mg/ml)
2、各药物干预后细胞内cAMP浓度检测结果： I) cAMP标准曲线 在Mouse/Rat cAMP Assay kit的可靠定量范围内，标准品cAMP与吸光值成浓度依赖 关系，拟和曲线为 y=(a+bx)~(-l/c)，其中，a、b、c 为常数，a= 3. 202598，b= 0· 18163734，c= I. 5075207,相关系数r大于0. 99,标准曲线见图12。
[0109] 各药物干预后细胞内cAMP的浓度 试验药物 PP〇lb、ppOlc、Exendin-4 被稀释成 5 个梯度浓度（ΚΓ1(Ι、10-9、10-8、ΚΓ7、KT 6 mol/L)与IBMX (100 μ mol/L)共孵育PC12细胞30min，各试验药物的生物活性如表2所示。
[0110] 表2各药物干预后细胞内cAMP的浓度（X土s)pmol/mL (n=3 in each group)
P是样品组与control组相比较的值。
[0111] 由上表2数据可以看出，在KTic^KT6 mol/L药物浓度范围内，各试验药物的浓度 与cAMP的量呈浓度依赖关系。当试验药物浓度在10_9~10_ 6 mol/L范围内，样品组细胞内 cAMP的量与空白对照组（control)的比较具有显著性差异（p < 0. 05)。相同浓度条件下， 当试验药物的浓度增加到一定程度，细胞内cAMP的量不再增加，这可能是由于试验药物与 PC12细胞的GLP-I受体的结合已达到饱和。
[0112] 另，将cAMP的浓度换算成相当于总蛋白的含量，如表3所示。
[0113] 表3各药物干预后细胞内cAMP的浓度（X土s)pmol/mg (n=3 in each group)
P是样品组与control组相比较的值。
[0114] 由表3所示数据，可以看出，ppOlb刺激细胞产生的最大cAMP的量是 73. 312±4· 407pmol/mg，pp01c 刺激细胞产生的最大 cAMP 的量是 109. 021±4· 387pmol/mg， Exendin-4刺激细胞产生的最大cAMP的量是68. 629±8. 416pmol/mg。说明在Exendin-4 C 末端进行结构修饰得到的本发明所提供的化合物生物活性优于Exendin-4。
[0115] 试验药物刺激PCl2细胞产生cAMP的量效关系 采用GraphPad Prism 5软件进行制图并计算药物的半效反应剂量（EC50)，如图13所 示。ppOlb 的 EC50 是 5. 098nmol/L，ppOlc 的 EC50 是 7. 210nmol/L，Exendin-4 的 EC50 是 5.096nmol/L〇
[0116] 试验实施例2 ppOlb和ppOlc降血糖实验 以本发明提供的化合物PP〇lb、ppOlc和ppOlk为例，说明本发明提供化合物体内活 性： 以本发明提供的化合物PP〇lb、ppOlc和ppOlk作为实验药物，以艾塞那肽和生理盐水 做对照，将生理状态相同的雄性大鼠，分为5组(每组4只)，禁食24h，在五组大鼠腹腔同时 注射葡萄糖（20mmol/kg，体重)，然后分别按照以下处理： 实验组：注射分别注射 ppOlb (10nmol/kg)、pp01c (10nmol/kg)、pp01k (10nmol/kg); 对照组1 :注射艾塞那肽(与实验组相同剂量）； 对照组2 :注射生理盐水（体积与实验组相同）。注射后于0、15min、30min、60min、 240min、480min尾静脉采血，用葡萄糖氧化酶法（GOD法）检验血液中葡萄糖含量，实验结果 如下表4所示： 表4
从表4实验结果看，艾塞那肽在约0. 5时达到稳定降糖效果，与生理盐水相比，血糖约 降低16% ;本发明提供的化合物pp01b、pp01c和ppOlk约在0· 5h时也实现了相应的降糖作 用，并且均在约I. 5h时候，达到了最为显著的降糖效应，和生理盐水组相比较，血糖约降低 了 70%，并且降糖效应可维持超过8h。
[0117] 通过胰岛素的酶联免疫试剂盒检验血液中的胰岛素含量，检测结果如表5所示： 表5
有胰岛素含量检测结果可看出，艾塞那肽在大鼠血液中的胰岛素含量在约〇.5h后达 到峰值，而化合物PP〇lb、ppOlc和ppOlk均在约I. 5h后实现血液中胰岛素的峰值。
[0118] 按小时抽取实验小鼠血液，检测其中艾塞那肽含量，经测定，pp01b、pp01c和 PPOlk在大鼠体内的半衰期与艾塞那肽相比显著延长。
[0119] 本发明提供的艾塞那肽衍生物具有改善的药代动力学性质，能显著降低血糖，具 有与艾塞那肽相当或更优的生物学活性。并且本发明提供的艾塞那肽衍生物显著延长了半 衰期，并且体内稳定性大大优于艾塞那肽，降糖效果更加明显。
[0120] 应当说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本 发明的精神和原则之内，本领域技术人员对本发明前述各实施例所记载的技术方案进行任 何修改，或对其中部分技术特征进行等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 化合物：D-A-P-L 其中D为GLP-1类似物部分； A具有如下的结构：-NRi-X-NR^， 其中，&、R2独立的选自H和k的烷基； X选自： (1) _(CH2)n_，其中n为2~10的整数； (2) -[ (CH2)nZ]p(CH2)n-，其中Z为0、NR3或S，n独立的选自f10的整数，p为(T10的 整数，其中R3为H或(^6的烷基； (3) 氨基酸残基或被一种或多种取代基取代的氨基酸残基，所述取代基选自H，(V6的烷 基、羰基和_NR2R3，其中，R2、R3独立的选自H和Cm的烷基； (4) -(CH2)nC(0)Z(CH2)n-，其中Z为0或单键，n独立的选自广10的整数； 和 (5) (^_1(|的亚烷基，并且，所述亚烷基中的H被一种或多种下列取代基取代，所述取代基选自 _C4的直链或支链烷基、卤素、NHR5、CN、羧基、硝基和的烷基醇； 其中，％Au&q 的直链或支链烷基； P为含有寡聚乙二醇类的连接部分，L是亲脂性连接部分； 并且，D的末端氨基酸残基的碳端与A的N&通过酰胺键连接，A的NR2与P通过酰胺 键连接，P与L通过酰胺键连接。2. 如权利要求1所述化合物，其中，P是具有如下结构的部分：L具有如下结构：其中，m是广20的整数；k是6~20的整数；波浪线"！ "表示连接位点。3. 如权利要求1所述化合物，其中，A具有如下结构：4. 如权利要求1所述化合物，具有如下结构：5. 如权利要求4所述的化合物，其中，GLP-1类似物选自以下：GLP-1 (7-35)、 GLP-1 (7-36)、GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-38)、GLP-1 (7-39)、GLP-1 (7-40)、GLP-1 (7-41)、 GLP-1 (7-42)、GLP-1 (7-43)、GLP-1 (7-44)、GLP-1 (7-45)、GLP-1 (7-46)或其类似物。6. 如权利要求5所述的化合物，其中，GLP-1类似物为包含以下氨基酸序列的肽：aa7-aa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-aal6-Ser-aal8-aal9-aa2〇-Glu-aa22-aa23-Ala-aa2 5-aa26-aa27-Phe-Ile-aa30-Trp-Leu-aa33-aa34-aa35-aa36-aa37-aa38-aa39_aa40-aa41 -aa42-aa43-aa44-aa45_aa46 ; 其中，aa7是L-His、D-His、2_氨基组氨酸、组氨酸或a-甲基组氨酸； aa8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、l_氨基环丙基羧酸、1-氨基环丁基羧酸、1-氨 基环戊基羧酸或1-氨基环庚基羧酸；aal6是Val或Leu;aal8是Ser、Lys或Arg;aal9是 Tyr或Gin;aa20 是Leu或Met;aa22 是Gly、Glu或Aib;aa23 是Gln、Glu、Lys或Arg;aa25 是Ala或Val;aa26 是Lys、Glu或Arg;aa27 是Glu或Leu;aa30 是Ala、Glu或Arg;aa33 是Val或Lys;aa34 为Lys、Asn、Glu或Arg;aa35 是Gly或Aib;aa36 是Lys、Gly或Arg; aa37是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、氨基或不存在；aa38是Lys、Ser、氨基或不存在；aa39是 Ser、Lys、氨基或不存在；aa40是Gly、氨基或不存在；aa41是Ala、氨基或不存在；aa42是 Pro氨基或不存在；aa43是Pro氨基或不存在；aa44是Pro氨基或不存在；aa45是Ser、氨基 或不存在；3346是氨基或不存在，并且，当3337、3338、3339、3&4〇3341、3342、3343、3&44、 aa45或aa46不存在时，相应的其后的氨基酸也不存在。7. 如权利要求6所述化合物，其中，GLP-1类似物选自： Arg34GLP-l(7-37) ,Lys38Arg26>34GLP-1 (7-38) ,Lys38Arg26>34GLP-1 (7-37) -OH,Lys36Arg26'34GLP-l(7-36)、Aib8'22'35GLP-l(7-37)、Aib8'35GLP-l(7-37)、 Aib8'22GLP-l(7-37)、Aib8'22'35Arg26'34GLP-l(7-38)、Aib8'35Arg26'34Lys38GLP-l(7-38)、 Aib8'22Arg26'34Lys38GLP-l(7-38)、Aib8'22'35Arg26Lys38GLP-l(7-38)、 Aib8Arg26Lys38GLP-l(7-38)、Aib8'35Arg26Lys38GLP-l(7-38)、Aib22Arg26Lys38GLP-l(7-38)、 Aib8'22'35Arg34Lys38GLP-l(7-38)、Aib8'35Arg34Lys38GLP-l(7-38)、 Aib8'22'35Ala37Lys38GLP-l(7-38)、Aib8'35Ala37Lys38GLP-l(7-38)、Aib8' 35Ala37Lys38GLP-l(7-38)、Aib8'22Ala37Lys38GLP-l(7-38)、Aib8'22'35Lys37GLP-l(7-38)、 Aib8'35Lys37GLP-l(7-38)和Aib8'22Lys37GLP-l(7-38)。8. 如权利要求5所述化合物，其中，GLP-1类似物为Exendin-3、Exendin-4或其衍生 物。9. 权利要求4所述的化合物，具有如下结构：、、 、 CN104945499A _权利要求书_ _4/4页波浪线"I"表示连接位点。10. -种药物组合物，包含权利要求1所述化合物，以及任选的药学可接受的载体。
【专利摘要】本发明涉及结构修饰的GLP-1类似物及其制备方法，具体涉及艾塞那肽衍生物及其制备方法；和含有它们的药物组合物及其在治疗疾病如II型糖尿病中的用途。本发明所提供的艾塞那肽衍生物是在艾塞那肽C末端进行结构修饰，制备得到化合物能显著提供细胞内cAMP含量，并且，动物实验表明，本发明提供的艾塞那肽衍生物具有与艾塞那肽相当甚者更优的生物活性，同时，本发明所提供的化合物与艾塞那肽相比，稳定性好，体内半衰期显著延长。
【IPC分类】A61K38/26, A61K47/48, C07K14/605, A61P3/10
【公开号】CN104945499
【申请号】CN201410124461
【发明人】袁建栋, 黄仰青, 宋云松, 顾家宁, 杨晴铖, 朱锐, 季南南, 方程, 姚翠萍
【申请人】博瑞生物医药技术(苏州)有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2014年3月31日
【公告号】WO2015149627A1