4. 2. 3实施定量PCR的检测结果
[0143] 对实施例3中筛选出的6个微小RNA的抑制物对靶基因的上调情况进行了检测， 每个微小RNA除了检测表2中自身对应的靶基因外，同时检测其余5个微小RNA所对应的 靶基因，以检测单一靶基因是否被多个微小RNA抑制剂所上调，并对靶基因能够被微小RNA 上调表达的程度进行显著性检验，*表示P〈〇. 05时有显著性差异；**表示P〈0. 01时有显著 性差异，具体每个基因上调表达的情况见附图5a、5b和5c。然后，将四个时间点中任一时间 点能够被上述至少一种微小RNA抑制剂显著上调的靶基因挑选出来，总结在表4中。
[0144] 表 4
[0145]
[0146] 4. 3蛋白水平上验证微小RNA的靶基因
[0147] 4. 3. 1实验材料：除下列试剂外，其余材料同实施例一和实施例三。
[0148] 一抗：抗HLTF兔多克隆抗体（abeam公司，编号为abl55031，稀释比例1/500);
[0149] 抗DAGl兔多克隆抗体（abeam公司，编号为abl05504,稀释比例1/1000);
[0150] 抗Laminin alpha4兔多克隆抗体（abeam公司，编号为ab69634,稀释比例1/200);
[0151] 抗Ube2H小鼠单克隆抗体（abeam公司，编号为ab58261，稀释比例1/1000);
[0152] 抗MCTPl兔多克隆抗体（abeam公司，编号为ab83673,稀释比例1/500);
[0153] 抗KIAA1429兔多克隆抗体（abeam公司，编号为abllOll，稀释比例1/1500);
[0154] 抗CPD兔多克隆抗体（abeam公司，编号为abl53874,稀释比例1/500);
[0155] FRMD6兔多克隆抗体（abeam公司，编号为abl21133,稀释比例1/500);
[0156] 抗TRM24兔多克隆抗体（abeam公司，编号为ab70560,稀释比例1/1000);
[0157] 抗RPAIN小鼠多克隆抗体（abeam公司，编号为ab88660,稀释比例1/500);
[0158] 抗IP6K1兔多克隆抗体（abeam公司，编号为ab96210,稀释比例1/500);
[0159] 抗ESMl兔多克隆抗体（abeam公司，编号为abl03590,稀释比例1/200);
[0160] 抗SLC9A6小鼠单克隆抗体（abeam公司，编号为ab77110,稀释比例/200);
[0161] 抗ZCCHC6小鼠多克隆抗体（abeam公司，编号为ab76901，稀释比例1/200);
[0162] 抗SDCBP兔单克隆抗体（pitomics公司，编号为RabMAb5913_l，稀释比例 1/2000)；
[0163] 抗TFPI兔单克隆抗体（印itomics公司，编号为RabMAb5853_l，稀释比例 1/1000)；
[0164] 抗DPP3兔单克隆抗体（印itomics公司，编号为RabMAb6523_l，稀释比例 1/2000)；
[0165] 抗RCANl兔单克隆抗体（印itomics公司，编号为RabMAb6846-l，稀释比例 1/1000)；
[0166] 抗SKIL兔多克隆抗体（CST公司，编号为cst4973,稀释比例1/200);
[0167] 抗CFLAR兔单克隆抗体（epitomics公司，编号为cst8510,稀释比例1/500)。
[0168] 4. 3. 2实验方法
[0169] a)种细胞：将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，种到12孔板中，每孔IO5个/ml细 胞，每孔体积Iml;
[0170] b) 37 °C，5%的CO2孵箱中培养24小时后，转染微小RNA抑制物和对照抑制物，抑 制物的终浓度为IOOnM ;
[0171] c)转染4小时后更换培养基；转染24小时后加入Ad-GP和Ad-Λ El ;
[0172] d)感染后24h用细胞裂解液裂解细胞收取细胞蛋白样品；
[0173] e)利用BCA蛋白质定量试剂盒(天根，PA115)将样品蛋白浓度调成一致；
[0174] f))加入等体积的2 X SDS加样缓冲液，95°C变性10分钟，放回冰上；
[0175] g)将蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝胶电泳；
[0176] h)显影检测蛋白表达情况，用密理博（millipore)ECL显色液，发光时间约为10分 钟。
[0177] 4. 3. 3实验结果
[0178] 从附图6及附图7a、7b上可以看出，微小RNA抑制物可以抑制相关微小RNA的表 达，使得其对应的靶基因编码的蛋白表达被上调。其中，序列号为SEQ ID NO. 34的DAGl蛋 白、序列号为SEQ ID NO. 38的KIAA1429蛋白、序列号为SEQ ID NO. 40的CPD蛋白、序列号 为SEQ ID NO. 43的TFPI、序列号为SEQ ID NO. 44的CFLAR蛋白、序列号为SEQ ID NO. 46的 RCANl蛋白、序列号为SEQ ID NO. 47的TRM24蛋白以及序列号为SEQ ID NO. 52的ZCCHC6 蛋白被明显上调。由此可进一步确定，这些基因是受其相应的微小RNA调控的，并且也参与 GP导致细胞变圆、脱落过程的。因此，以这些蛋白为对象在体外进行预防和/或治疗埃博拉 病毒感染药物的筛选应用中，只要能够上调上述蛋白表达的药物均可以有效地减弱埃博拉 病毒感染后细胞变圆脱落的表型，提高细胞的存活率。
[0179] 4. 4体内实验验证微小RNA所调控的靶基因
[0180] 4. 4. 1实验材料：除下列试剂外，其余材料同实施例一。
[0181] 双突光素酶报告系统（dual luciferae reporter assay system，promega);人 胚肾 293T 细胞；良伊格尔培养基培养基（Dulbecco, s modified Eagle' s medium，DMEM， Gibco,加入10% (v/v)胎牛血清，青霉素（lOOU/ml)和链霉素（100mg/ml);转染试剂：脂质 体lipofectamine2000 (invitrogen);双突光素酶报告质粒psiCHEC-2 (上海生工）
[0182] 4. 4. 2实验方法
[0183] a)种细胞：用DMEM将293T细胞配制成单细胞溶液，种到24孔板中，每孔IO5AiL 个细胞，每孔体积50〇μ 1 ;
[0184] b) 37°C，5%C02孵箱培养24小时后转染微小RNA的类似物，对照组转入对照类似 物，转染6小时后更换培养基。此处，微小RNA的类似物及对照类似物均为双链RNA序列， 其中微小 RNA hsa-miR1246、hsa-miR320a、hsa-miR196b_5p 和 hsa-miR34a_5p 的类似物的 正义链（sense strand)序列分别为 SEQ ID NO. 67、SEQ ID NO. 68、SEQ ID NO. 69 以及 SEQ ID NO. 70,对照类似物的正义链序列为SEQ ID NO. 71，所有类似物的反义链序列均与其对 应的正义链序列碱基互补配对。
[0185] c)转染24h后转染对应的双荧光素酶报告质粒，该质粒同时包含靶基因3' -UTR， 海肾荧光报告基因和萤火虫荧光报告基因，其中萤火虫荧光报告基因作为转染效率的内部 参考。对照组转入3'-UTR突变质粒，实验组转入3'-UTR野生型质粒，48h后检测海肾荧光 素酶活性。微小RNA对应的靶基因的野生型3' -UTR序列与对应的突变型3' -UTR序列信 息见表5。
[0186] 表 5
[0187]
[0188] 4. 4. 3实验结果
[0189] 由于微小RNA主要通过作用于靶基因的3' UTR发挥抑制靶基因的功能，可以将目 的基因 3'UTR区域构建至载体中报告基因海肾荧光素酶的后面，通过比较干扰微小RNA后， 报告基因表达的改变(监测萤光素酶的活性变化)可以定量反映微小RNA对目的基因的抑制 作用；结合定点突变等方法可以进一步确定微小RNA与靶基因 3' UTR的作用位点。
[0190] 附图8a和图8b中显示了正义链序列为SEQ ID NO. 67的双链hsa-miR-1246的类 似物能够很显著地抑制靶基因序列为SEQ ID NO. 24的CFLAR和序列为SEQ ID NO. 32的 ZCCHC6的表达，而当这两个基因的3'-UTR发生突变时，hsa-miR-1246的类似物就不再能抑 制这两个基因的表达。同理，正义链序列为SEQ ID NO. 68的双链hsa-miR-320a的类似物 能够明显抑制序列分别为SEQ ID NO. 23的TFPI、SEQ ID NO. 14的DAGl、SEQ ID NO. 20的 CPD以及EQ IDN0. 18的KIAA-1429四个基因的表达，而当这四个基因的3' -UTR发生突变 时，hsa-miR-320a的类似物对这四个基因的抑制作用就表现的不明显。正义链序列为SEQ ID NO. 69的双链hsa-miR196b-5p的类似物能够明显抑制序列为SEQ ID NO. 23的TFPI的 基因表达，而当TFPI基因的3'-UTR发生突变时，hsa-miR-196b-5p的类似物对这个基因的 抑制作用就表现的不明显。正义链序列为SEQ ID NO. 70的双链hsa-miR-34a的类似物能 明显抑制序列为SEQ IDN0. 26的RCANl基因的表达，而当RCANl基因 3' -UTR发生突变时， hsa-miR-34a的类似物就不能明显表现出对RCANl基因的抑制作用。
[0191] 实施例五、确定靶基因与细胞脱落表型之间的关系
[0192] 5. 1用双链寡核苷酸RNA降低靶基因的表达验证靶基因促进细胞脱落方面的作用
[0193] 5. 1.1实验方法
[0194] a)将HUVEC用ECM重悬成单细胞溶液，种到96孔板中，每孔IO5个/ml细胞，每孔 体积100 μ 1 ;
[0195] b) 37°C，5%C02孵箱培养24h后转染靶基因 DAGl、TFPI以及CFLAR的双链寡核苷 酸干扰RNA，对照组转入对照双链寡核苷酸干扰RNA，终浓度ΙΟΟηΜ，转染4h后更换培养基；
[0196] 靶基因 DAGl中RNA干扰的靶序列为SEQ ID NO. 88,其双链寡核苷酸干扰RNA的正 义链的序列为SEQ ID NO. 89,反义链从3'端到5'端的序列为SEQ ID NO. 90 (广州锐博合 成，产品编号为：siG000001605B)。
[0197] 靶基因 TFPI中RNA干扰的靶序列为SEQ ID NO. 91，其双链寡核苷酸干扰RNA的正 义链的序列为SEQ ID NO. 92,反义链从3'端到5'端的序列为SEQ ID NO. 93 (广州锐博合 成，产品编号为：siG000007035C)。
[0198] 靶基因 CFLAR中RNA干扰的靶序列为SEQ ID NO. 94,其双链寡核苷酸干扰RNA的 正义链的序列为SEQ ID NO. 95,反义链从3'端到5'端的序列为SEQ ID NO. 96 (广州锐博 合成，产品编号为：siG000008837A)。
[0199] 对照双链寡核苷酸干扰RNA的靶序列为SEQ ID NO. 158 :TTCTCCGAACGTGTCACGT。 正义链序列的末尾两位碱基为dTdT，其余碱基序列SEQ ID NO. 159为 UUCUCCGAACGUGUCACGU，反义链3'至5'的前两位碱基为dTdT，其余碱基的序列SEQ IDN0. 160 为 AAGAGGCUUGCACAGUGCA (广州锐博合成)。
[0200] 其中，上述双链寡核苷酸干扰RNA的正义链和反义链的3'末端的最后两位核苷酸 为dTdT序列，以减少细胞内降解。
[0201] c)转染24h后加入等量的Ad-GP和Ad- Λ El，48h后进行MTS实验检测细胞存活 率。
[0202] 5. L 2实验结果
[0203] 由于小干扰RNA设计的有效性不能完全预知，部分微小RNA的小干扰RNA容易由 于设计的原因，对靶基因的降低效果不明显，在附图9中没有示出，附图9中仅显示了能明 显降低靶基因表达的小干扰RNA及对应的靶基因经过MTS试验后检测到的细胞的存活率。 从附图9中可以看出，TFPI、DAG1、CFLAR对应的双链寡核苷酸干扰RNA均能显著降低相应 靶基因的表达量，而当上述三个蛋白表达被降低后，相应的细胞的存活率就明显下降了，说 明上述6个微小RNA的靶基因中，至少这三个基因的表达显著降低后，相应的Ad-GP组感染 后的细胞脱落程度加剧，细胞的存活率下降。
[0204] 5. 2用过量表达靶基因的方法验证靶基因在抑制细胞脱落方面的作用
[0205] 5. 2. 1实验材料：除下列材料外，其余同其他实施例
[0206] 人胚肾 293T 细胞；良伊格尔培养基（Dulbecco，s modified Eagle' s medium, DMEM，Gibco,加入10% (v/v)胎牛血清，青霉素（lOOU/ml)和链霉素（100mg/ml);靶基因过 表达质粒分别为：Peakl3-TFPI-flag，Peakl3-DAGl-flag，Peakl3-CFLAR-flag ;GP 以及 GP 缺失导致细胞脱落的关键毒性区域的质粒即GP- Λ mucin表达质粒同实施例一；转染试剂 脂质体lip〇fectamine2000 ;血球计数板。
[0207] 5. 2. 2实验方法
[0208] a)用DMEM将293T细胞配成单细胞溶液，种到12孔板，每孔IO5AiL个细胞，每孔 体积Iml ;
[0209] b)培养 24h 后共同转染序列为 SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 14 和 SEQ ID NO. 24 的 靶基因表达质粒和GP表达质粒或序列为SEQ ID NO. 97的GP- Λ mucin (即GP缺失mucin 区域，文献研究报道此区域是GP导致细胞脱落的关键毒性区域)的表达质粒，对照组共同转 染peakl3_GFP表达质粒和GP表达质粒或序列为SEQ ID NO. 97的GP- Λ mucin表达质粒， 4小时后更换培养基；
[0210] c)转染48h后对漂浮细胞进行计数分析。
[0211] 5. 2. 3实验结果
[0212] 附图10中显示了靶基因 TFPI、DAG1和CFLAR被过量表达后，过表达组的细胞的脱 落程度被明显缓解，说明这三个靶基因表达上调后可以明显抑制埃博拉病毒包膜糖蛋白GP 导致的细胞变圆脱落的表型，从而提高细胞的存活率。此外，附图11中还显示了不同靶基 因相互组合过表达后对细胞的脱落程度的缓解情况，表明这三个靶基因之间的不同组合也 能够抑制埃博拉病毒包膜糖蛋白GP导致的细胞变圆脱落的表型，从而提高细胞的存活率。
[0213] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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